1、目的:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為實驗對象，通過晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)干預(yù)以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stemcells，hMSCs)與HUVEC共培養(yǎng)，應(yīng)用Western blot、PCR等方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular end

2、othelial growth factor，VEGF）及其受體和下游PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達(dá)變化，探討VEGF信號通路在糖尿病大血管病變血管新生障礙中的病理改變和機制以及間充質(zhì)干細(xì)胞對糖尿病患者血管新生促進(jìn)作用的影響機制。
　　方法:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實驗。實驗分三組:AGE組、AGE+MSC共培養(yǎng)組，空白對照組（不加任何刺激因素）。對照組常規(guī)培養(yǎng)HUVEC;

3、 AGE組以400ug/ml濃度的AGE與HUVEC共孵育36小時（已經(jīng)通過預(yù)實驗確定AGE最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間，具體見后。）;AGE+MSC共培養(yǎng)組在400ug/ml AGE環(huán)境下將MSC與HUVEC共培養(yǎng)36小時。36小時后提取各組HUVEC的蛋白和mRNA并留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液備用。采用Westernblot、PCR方法檢測3組內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、sFlt-1(s

4、oluble VEGFR-1)、p-AKT、p-eNOS的表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、AGE影響VEGF-A和VEGFR的表達(dá)
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞VEGFA、sFlt-1 mRNA表達(dá)（3.747±0.415）與對照組（1.007±0.139）相比升高，差異有

5、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);VEGFR-2mRNA表達(dá)與對照組相比減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　400ng/ml AGE干預(yù)36小時后，內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-1蛋白表達(dá)（93.129±4.620）與對照組（557.395±9.383）相比下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);VEGFR-2蛋白表達(dá)(63.791±7.98)與對照組（571.995±12.65）相比下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　

6、2、AGE影響PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達(dá)
　　400ng/ml AGE干預(yù)36小時后，內(nèi)皮細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)（86.408±3.255）與對照組（482.325±39.859）相比減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;p-eNOS蛋白表達(dá)（187.69±20.732）與對照組(426.96±50.063)相比亦減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、與MSC共培養(yǎng)對內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR的表達(dá)的影響

7、
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞sFlt-1 mRNA表達(dá)與對照組相比升高，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，sFlt-1 mRNA（2.048±0.245）表達(dá)與AGE組相比下降（P＜0.05）;
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-1與正常對照組相比表達(dá)下降，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-1（319.43±3.649）蛋白表達(dá)與AGE組相比升高(P＜0.05);AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-2與正常對照組相比表達(dá)明顯下降，

8、經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-2（202.81±48.879）蛋白表達(dá)與AGE組相比升高(P＜0.05)。
　　4、與MSC共培養(yǎng)對內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達(dá)的影響
　　AGE干預(yù)后，p-AKT、p-eNOS與正常對照組相比表達(dá)明顯減弱，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，p-AKT蛋白表達(dá)（238.385±30.384）與AGE組相比升高(P＜0.05)，p-eNOS蛋白表達(dá)（255.545±9.227）與AGE組