1、目的：建立Sprague-Dawley（SD）大鼠糖尿病模型，通過伊文思藍（evans blue， EB）灌注大鼠視網(wǎng)膜后在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中制作透明視網(wǎng)膜標(biāo)本，直接在普通熒光顯微鏡下觀察早期糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）血視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）功能的改變；通過玻璃體腔移植人臍帶間充質(zhì)干細胞（human

2、 umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs），觀察其對DR大鼠BRB的影響。
　　方法:（1）40只雄性SD大鼠隨機分為正常對照（CON）組10只大鼠和糖尿病組30只大鼠。腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病模型，根據(jù)病程，將糖尿病組大鼠分為糖尿病1個月（DM-1m）組、糖尿病3個月（D

3、M-3m）組及糖尿病6個月（DM-6m）組；CON組大鼠腹腔注射等容量枸櫞酸緩沖液。于各相應(yīng)時間點經(jīng)股靜脈按45mg/kg注射30g/L的EB溶液，循環(huán)15min后摘除雙側(cè)眼球，立即置于 PBS中完整剝離視網(wǎng)膜，放射狀切開并平鋪于載玻片上，避光晾至完全透明，封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。應(yīng)用IPP6.0軟件分析圖像，測量并比較EB滲漏區(qū)面積與視網(wǎng)膜面積的百分比。（2）60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、DR模型對照組及NSCs治療

4、組，其中正常對照組12只大鼠，DR模型對照組及NSCs治療組各24只大鼠。DR模型對照組和NSCs治療組大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3個月，NSCs治療組大鼠右眼玻璃體腔注射2μl NSCs懸液（2×104/μl）；DR模型對照組大鼠右眼注射等容量 PBS；上述兩組大鼠左眼及正常對照組大鼠雙眼不給予任何干預(yù)。干預(yù)1個月后，采用EB灌注血管視網(wǎng)膜鋪片觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)及滲漏情況；EB定量檢測BRB破壞情況；病理學(xué)切片觀

5、察視網(wǎng)膜組織改變情況。
　　結(jié)果:（1）糖尿病組大鼠較CON組血糖明顯升高，體重明顯下降（均P＜0.05）。CON組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)和走形正常，紅色熒光均勻充盈于血管腔。糖尿病成模1個月時，大鼠視網(wǎng)膜背景熒光較CON組略有增強；3個月時，背景熒光進一步增強，視網(wǎng)膜血管呈節(jié)段性擴張，可見明顯的紅色高熒光區(qū)；6個月時，視網(wǎng)膜血管粗細不均，部分走行迂曲，可見片狀低灌注區(qū)及大量高熒光區(qū)。CON、DM-1m、DM-3m、DM-6m組 EB

6、滲漏區(qū)面積百分比分別為（0.05±0.02）％、（0.27±0.06）%、（1.17±0.18）%及（4.77±0.66）%，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=795.800，P＜0.000），其中DM-3m、6m組均明顯高于CON組（q’=10.338， q’=43.475；均P＜0.000）。（2）NSCs治療組血糖較正常對照組明顯升高、體重明顯下降（P＜0.05），與DR模型對照組無明顯差異。EB灌注視網(wǎng)膜鋪片檢查顯示，正常對照組大鼠

7、視網(wǎng)膜血管無明顯異常，無EB滲漏到血管外；DR模型對照組背景熒光增強，可見明顯的EB滲漏高熒光區(qū)；NSCs治療組背景熒光略增強，EB滲漏區(qū)較DR模型組明顯減少。EB滲漏定量分析顯示，DR模型對照組大鼠視網(wǎng)膜平均EB滲漏量較正常對照組增加（P＜0.05）；NSCs治療組較DR模型對照組明顯減少（P＜0.05）。視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查示正常對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、形態(tài)正常；DR模型對照組視網(wǎng)膜細胞排列較紊亂，神經(jīng)纖維層高度水腫，細

8、胞核腫脹、體積增大，細胞密度降低；NSCs治療組視網(wǎng)膜細胞較DR模型對照組略整齊，神經(jīng)纖維層水腫明顯減輕。
　　結(jié)論:（1）EB灌注大鼠視網(wǎng)膜后在PBS中制作透明視網(wǎng)膜標(biāo)本的方法，可在普通熒光顯微鏡下獲得清晰的大鼠視網(wǎng)膜熒光顯微鏡像；（2）STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型成模3個月時可作為早期DR模型用于實驗研究；（3）通過玻璃體腔移植hUCMSCs誘導(dǎo)的NSCs，能夠改善BRB功能，減少早期DR大鼠血管滲漏，從而達到防治DR進展的治療