1、[研究背景與目的]心血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類(lèi)死亡的最主要原因之一，而衰老是心血管疾病發(fā)生的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究衰老的發(fā)生機(jī)制和減緩衰老的有效干預(yù)措施對(duì)心血管疾病的防治具有重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道，硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）具有拮抗衰老的作用，但其具體機(jī)制仍未完全闡明。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2同源物1（silentinformationregulator2homolog1,SIRT1）是一種高度保守的NAD+依賴(lài)性

2、蛋白脫乙?；福赏ㄟ^(guò)使叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box Otranscription factor1,FoxO1）脫乙?；瘉?lái)抵抗氧化應(yīng)激，從而延緩衰老。H2S可調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)及活性。本研究旨在探討 SIRT1/ FoxO1信號(hào)通路在 H2S拮抗過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide,H2O2）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）衰老中

3、的作用。
　　[實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果]1.采用0、25、50和100μmol/L H2O2處理內(nèi)皮細(xì)胞1 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,SA-β-gal染色以及western blot檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P53、P21、PAI-1的表達(dá)，以確定H2O2誘導(dǎo)HUVECs衰老的最適濃度。SA-β-gal染色結(jié)果顯示，100μmol/L H2O2組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，約是對(duì)照組的8.4倍（P<0.01）。Western bl

4、ot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，100μmol/LH2O2組的P53、P21和PAI-1蛋白表達(dá)分別增加了60.5％、5.8倍和1.6倍（P<0.01）。2.分別采用0、25、50、100、200μmol/L的外源性H2S供體NaHS預(yù)先處理HUVECs30 min，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，100μmol/LH2O2再作用1 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，與H2O2組相比，100μmol/L NaHS組的SA-β-gal

5、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及P53、P21和PAI-1蛋白表達(dá)分別下降了43.8%、49.7%、49.4%和67.6%（P<0.01）。3.細(xì)胞隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、100μmol/L H2O2組、100μmol/L NaHS+100μmol/L H2O2組，檢測(cè)各組SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達(dá)，DCFH-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，改良的生物素轉(zhuǎn)換法測(cè)定SIRT1的硫-巰基化情況。結(jié)果顯示

6、，與對(duì)照組相比，H2O2組的SIRT1、FoxO1、MnSOD和catalase蛋白表達(dá)分別減少了61.4%、28.3%、43.9%和45.4%（P<0.05），但Ac-FoxO1/ FoxO1比值與ROS水平分別增加了84%和2.8倍（P<0.01）；NaHS+H2O2組與H2O2組相比，SIRT1、FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達(dá)分別增加了2.2倍、84.1%、38%和38.7%（P<0.01），而Ac-FoxO1

7、/ FoxO1比值和細(xì)胞ROS水平分別下降了48.4%和46.2%（P<0.05）。此外，與對(duì)照組和H2O2組相比，NaHS+H2O2組的硫-巰基化SIRT1顯著增加（P<0.01）。4.細(xì)胞隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、H2O2組、NaHS+H2O2組和NaHS+H2O2+FoxO1 siRNA組。HUVECs長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，50 nmol/LFoxO1 siRNA處理細(xì)胞24h，再用NaHS孵育30min后換H2O2處

8、理1h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。檢測(cè) SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、SIRT1、FoxO1、Ac-FoxO1、MnSOD和catalase的蛋白表達(dá)，以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況。結(jié)果顯示，與 NaHS+H2O2組相比，NaHS+H2O2+FoxO1 siRNA組的SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、P53、P21和PAI-1的蛋白表達(dá)以及ROS水平分別增加了39%、65.5%、1.9倍、1.5倍和1.6倍（P<0.01）,而MnSOD與