1、目的：支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒中最常見的慢性肺部疾病。其肺組織病理主要表現(xiàn)出次級(jí)分隔縮短、肺泡數(shù)目減少、體積增大及結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化等肺泡化阻滯的現(xiàn)象。胎兒未成熟的肺暴露于宮內(nèi)炎性環(huán)境中，是 BPD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。在肺泡化進(jìn)程中，位于次級(jí)分隔頂端的肌成纖維細(xì)胞起重要作用。它能分泌彈性蛋白等基質(zhì)成分，促進(jìn)次級(jí)分隔延伸、成熟，最終將囊泡分隔、重塑形成肺泡。前期試驗(yàn)中，我們通過孕鼠羊

2、膜腔注射脂多糖（LPS）建立新生大鼠BPD模型，發(fā)現(xiàn)了肺組織中肌成纖維細(xì)胞分布異常。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探索LPS是否影響了肺組織肌成纖維細(xì)胞的定向遷移，從而引起其在肺組織中的分布異常，導(dǎo)致肺泡化阻滯的發(fā)生，并探討Csk/Src/EGFR信號(hào)傳導(dǎo)在LPS引起肌成纖維細(xì)胞定向遷移受損中的作用。
　　方法：⑴孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS后待其自然分娩，取7天新生鼠肺組織，提取原代肺肌成纖維細(xì)胞。通過高爾基體極性實(shí)驗(yàn)和 Tr

3、answell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察肌成纖維細(xì)胞的定向遷移能力是否受損。同時(shí)，體外培養(yǎng)人胚肺肌成纖維細(xì)胞，觀察 LPS刺激后，細(xì)胞定向遷移能力的變化。⑵提取羊膜腔注射 LPS的新生鼠肺組織原代肌成纖維細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中Csk，Src，EGFR蛋白的表達(dá)水平，以及Src和EGFR的磷酸化水平，觀察其是否被激活；用Csk活性試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Csk的活性。并觀察LPS體外刺激人胚肺肌成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞中Csk，Src，EGFR

4、活性的變化。⑶體外培養(yǎng)人胚肺肌成纖維細(xì)胞，觀察加入外源性rhTGF-α刺激或者用 EGFR特異性抑制劑 AG1478預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞定向遷移能力的改變，探討LPS是否通過EGFR影響細(xì)胞的定向遷移。利用shRNA下調(diào)Csk表達(dá)，或者通過Src抑制劑PP1以及轉(zhuǎn)染Src負(fù)隱性（DN-Src）質(zhì)粒抑制Src激活，觀察LPS是否通過Csk/Src影響EGFR的激活以及細(xì)胞的定向遷移能力。⑷孕16.5天的SD大鼠羊膜腔同時(shí)注射LPS和EGFR

5、抑制劑Erlotinib，取7天新生鼠肺組織，HE染色觀察肺組織病理改變，免疫熒光染色觀察肌成纖維細(xì)胞的分布，探討Erlotinib是否改善了LPS引起的肺組織BPD病理改變和肌成纖維細(xì)胞分布異常。
　　結(jié)果：①羊膜腔注射LPS的新生大鼠肺組織肌成纖維細(xì)胞較注射生理鹽水的肺肌成纖維細(xì)胞高爾基體極化能力降低（74.39±0.6848％vs56.95±1.457%，p<0.01），細(xì)胞遷移減少（46.27±5.347 vs20.07±

6、4.631，p<0.05）。體外LPS刺激人胚肺肌成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞的定向遷移能力同樣受損（高爾基體極化率降低：60.12±0.7442%vs41.65±0.7777%，p<0.01；遷移細(xì)胞數(shù)減少：37.6±1.208 vs19.6±0.8778，p<0.01）。②羊膜腔注射LPS的新生鼠肺組織原代肌成纖維細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但 Csk活性降低（降至73.6%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分別升高2.6倍，1.96倍

7、）。同樣的，體外LPS刺激人胚肺肌成纖維細(xì)胞30min后，細(xì)胞中Csk活性出現(xiàn)降低（降至70.3%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分別升高2.2倍，1.5倍）。③加入 rhTGF-α刺激細(xì)胞后，觀察到與 LPS作用類似的高爾基體極化率降低，遷移細(xì)胞數(shù)減少的現(xiàn)象，表明細(xì)胞定向遷移能力受損。而EGFR抑制劑AG1478可以阻斷LPS或者TGF-α對(duì)細(xì)胞定向遷移的影響。用PP1抑制Src活性或者轉(zhuǎn)染DN-Src質(zhì)粒，則可阻斷LPS對(duì)細(xì)胞中

8、EGFR活性和細(xì)胞定向遷移能力的影響。進(jìn)一步利用shRNA下調(diào)細(xì)胞中Csk表達(dá)后，也觀察到與LPS作用類似的EGFR活性增高，細(xì)胞定向遷移能力受損的現(xiàn)象。④羊膜腔同時(shí)注射LPS和EGFR抑制劑Erlotinib的肺組織較單獨(dú)注射LPS的肺組織中次級(jí)分隔數(shù)和終末肺泡數(shù)均有增高，分布在次級(jí)分隔的肌成纖維細(xì)胞也增多，Erlotinib改善了LPS引起的肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化和肺肌成纖維細(xì)胞分布異常的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了炎癥引起支氣管肺發(fā)