1、背景：
　　新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指圍生期各種因素，主要是指窒息，引起的新生兒腦能量代謝及功能障礙，重者出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，如抽搐、昏迷等，甚至在嬰兒期死亡，幸存者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，HIE是兒童致殘的重要原因。盡管目前圍生醫(yī)學在不斷的進步，圍產(chǎn)期窒息患兒發(fā)生率在逐漸減少，但HIE仍是一種威脅嬰幼兒健康的嚴重疾病，目前尚無特效治療。在國外亞低溫治療已經(jīng)成為新生兒腦損傷的常規(guī)治療，方法有選擇性頭部降溫或全身降溫。但Tag

2、inMA等進行Meta分析時，總結(jié)多項臨床試驗表明亞低溫治療對新生兒中度腦病作用顯著，對新生兒重度腦病作用不明顯。亞低溫雖然在國外廣泛用于臨床，但在國內(nèi)還未全面推廣，作為臨床醫(yī)師要認清其禁忌癥及并發(fā)癥，選擇亞低溫治療時要確保再灌注損傷階段的各種生理病理反應已減輕。當患兒存在嚴重感染，凝血功能障礙或多器官功能衰竭時要慎重選擇該治療方案。同時要注意治療時間窗的選擇，一般在出生后6小時內(nèi)，如果延遲至發(fā)病后8.5小時，亞低溫治療則沒有神經(jīng)保護作

3、用。在國內(nèi)被認為能夠有效改善HIE患兒預后的治療方法是高壓氧(HBO)治療，它能改善患兒的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，降低病死率和幸存患兒后遺癥發(fā)生率。國內(nèi)大量的臨床研究肯定了HBO對新生兒HIE的近期療效較好，但缺乏多中心隨機研究，關(guān)于HBO的遠期療效報道少。然而，國外醫(yī)學并不十分支持HBO在臨床的應用，他們認為HBO在治療局部缺血性腦卒中時能改善神經(jīng)行為和梗死面積，但應用到臨床上尚需要更多的臨床前研究證明HBO的有效性及作用機制。其它治療方法如氧

4、自由基抑制劑和清除劑，興奮性氨基酸拮抗劑、神經(jīng)保護劑、干細胞移植、基因治療等尚需更多的動物研究和臨床驗證。
　　臭氧用于消毒和治療疾病有150年的歷史了。1840年德國化學家C.ESchonbein電解水的時候發(fā)現(xiàn)一種特殊臭味的氣體，將它命名為臭氧。在一戰(zhàn)期間，德國士兵將臭氧用于治療厭氧菌感染所致的氣性壞疽，發(fā)現(xiàn)臭氧能控制感染，有抗炎的特性。1857年，兩位德國物理學家發(fā)明第一臺醫(yī)用臭氧發(fā)生機，臭氧治療開始用于臨床。1929年美國

5、出版了一本名為《臭氧及其醫(yī)療作用》的書，書中描述了臭氧能治療114種疾病。上個世紀50年代，由于缺乏基礎(chǔ)和臨床研究及臭氧本身存在的危害，臭氧的治療效果受到各界的質(zhì)疑。后來隨著醫(yī)學研究的不斷進展，積累了大量研究結(jié)果，其作用機制及效果逐漸被闡明，醫(yī)用臭氧逐漸被醫(yī)學工作者認可。1999年，意大利發(fā)起并建立了國際臭氧醫(yī)療協(xié)會(IMOS)，旨在促進醫(yī)用臭氧在臨床的研究與應用，制定臭氧治療規(guī)范。目前臭氧主要用于治療腰椎間盤突出、關(guān)節(jié)痛、肩周炎、糖尿

6、病潰瘍等疾病。臭氧在細胞有氧代謝及抗氧化防御系統(tǒng)方面起積極的作用，是治療能量衰竭有關(guān)疾病的基礎(chǔ)。臭氧能減少血膽固醇，刺激抗氧化應答，在靜止肌修飾氧合作用，改善神經(jīng)功能，是缺氧和缺血綜合征的補充治療。
　　動物，如大鼠、小鼠、兔、猴，對人類生物的研究有巨大的貢獻。除了人們熟悉的鼠、兔等動物外，斑馬魚作為一種逐漸興起的脊椎模式動物，憑借其節(jié)約成本、繁殖能力強、體積小、發(fā)育迅速、胚胎透明能夠輕易連續(xù)觀察發(fā)育階段以及其基因與人類基因高度相

7、似等特點已成為生物學家的新選擇。斑馬魚基因表達是保守的，與人類有69％的同源性，47％的人類基因與斑馬魚同源基因一一對應。通過檢測3176個人類致病基因，發(fā)現(xiàn)其中有82％在斑馬魚至少有一個同源基因。這也就意味著在斑馬魚身上進行的實驗所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適于人體，所以斑馬魚模型可以用于人類疾病的研究。斑馬魚可以模擬多種人類疾病，已有研究者利用斑馬魚胚胎和成魚制作缺氧缺血性腦損傷模型，研究其發(fā)病機制及治療方法。
　　目的：

8、>　　基于以上的研究背景，本實驗旨在利用便捷、高效的斑馬魚模型構(gòu)建斑馬魚幼魚缺氧再灌注損傷模型，模擬新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)，探討應用醫(yī)用臭氧對新生兒腦損傷的作用機制及影響。本研究通過觀察對腦組織氧化應激指標(超氧化物歧化酶(SOD)活性、（丙二醛）MDA、總抗氧化水平）及SODmRNA表達水平的影響，結(jié)合斑馬魚幼魚行為及病理學改變，探討醫(yī)用臭氧對缺氧性腦損傷的斑馬魚幼魚是否具有保護作用及相關(guān)機制，為新生兒缺氧缺血性腦損傷開拓

9、治療思路，并探索不同濃度對干預效果的影響，為進一步的臨床實驗提供實驗動物水平的研究資料，以期為臨床研究提供實驗室基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.動物模型的分組與建立
　　同一批次野生型斑馬魚卵受精后5天(dpf)，缺氧實驗前隨機分為正常對照組、H/R組（hypoxia/reoxygen，系統(tǒng)水復氧）、處理組（缺氧-醫(yī)用臭氧復氧組），其中處理組根據(jù)臭氧濃度不同分為:0.05ppm、0.1 ppm、0.2ppm三個亞組。均勻向

10、密閉水箱中充入高純氮氣，溶氧儀監(jiān)測氧濃度，當水中溶解氧低于0.5mg/L時，將H/R組和各處理組幼魚放入缺氧裝置中，建立斑馬魚幼魚缺氧腦損傷模型。到達實驗終點，即幼魚沉底靜止不動達1min，身體彎曲或抽搐，將幼魚撈出，分別放入系統(tǒng)水和醫(yī)用臭氧中進行復蘇，以缺氧/復氧后3h為觀察時間點。正常對照組水中溶解氧濃度在7.5mg/L左右。
　　2.各項指標的檢測方法
　　2.1 幼魚的一般狀況
　　復蘇期間計時各組幼魚蘇醒時間

11、，顯微鏡下觀察缺氧/復氧后3h幼魚心率變化、運動能力、生存分析等指標，初步評估缺氧/復氧對幼魚生存狀態(tài)的影響及醫(yī)用臭氧對幼魚的影響。
　　2.2 腦組織病理變化
　　顯微鏡下觀察TUNEL染色腦組織細胞凋亡變化。
　　2.3 腦組織氧化應激反應指標
　　測定各組斑馬魚幼魚缺氧/復氧后3h腦組織SOD、MDA、總抗氧化水平氧化應激指標。
　　2.4 腦組織SODmRNA表達水平
　　利用實時熒光定量PC

12、R(qRT-PCR)分析幼魚缺氧/復氧后3h腦組織SODmRNA表達水平。
　　3.統(tǒng)計方法
　　對檢測所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述，正態(tài)分布計量資料用均值±標準差(x±s)表示，結(jié)果用spss20.0統(tǒng)計軟件進行分析;兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's法進行分析。Kaplan-Meier法用于估計生存函數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應

13、用Graphpad Prism5.0作圖軟件進行數(shù)據(jù)的圖片處理。
　　結(jié)果：
　　1.動物一般狀況
　　正常組斑馬魚幼魚一般狀況良好，心率平穩(wěn)，運動能力正常。缺氧/復氧后3hH/R組幼魚運動能力減弱，游程縮短，出現(xiàn)抽搐、靜止不動等表現(xiàn)。缺氧/復氧后3h內(nèi)各組幼魚（H/R組、0.05ppm-臭氧組、0.1 ppm臭氧組、0.2-ppm臭氧組）平均蘇醒時間分別為:37.5±6.1 min、33.0±3.8min、32.5±

14、5.0min、32.6±5.6min，其中H/R組幼魚平均蘇醒時間最長，差異有顯著性。與正常對照組同一時間點相比，0.1ppm復氧組幼魚心率和H/R幼魚平均心率稍慢，但差異無明顯差異，0.05ppm復氧組和0.2ppm復氧組幼魚心率加快，但差異無顯著性。缺氧后14天內(nèi)，正常對照組、H/R及各處理組(0.05ppm、0.1 ppm、0.2ppm)幼魚中位生存時間分別為12.87天，7.67天，9.96天，10.35天，8.96天;總體生存

15、率差異有顯著性(P＜0.001)。
　　2.各組斑馬魚幼魚腦組織TUNEL染色
　　H/R和處理組幼魚腦組織TUNEL染色陽性細胞的核呈斑點狀棕褐色深染，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，呈顆粒狀分布于核周或濃縮成團，另有少數(shù)細胞核呈均勻黃色淡然，TUNEL染色陽性細胞散在分布于正常細胞之間，越靠近中心區(qū)域越明顯。0.05ppm臭氧水復氧組和0.2ppm臭氧水復氧組細胞凋亡指數(shù)與H/R無明顯差異，0.1 ppm臭氧水復氧組凋亡細胞指數(shù)明

16、顯低于H/R，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.各組斑馬魚幼魚腦組織氧化應激反應指標
　　3.1 各組幼魚腦組織總抗氧化水平變化
　　與正常對照組相比，H/R組3h總抗氧化能力下降，差異無顯著性(P＞0.05)，而處理組總抗氧化能力升高(P＜0.05)，其中0.1 ppm組上升最明顯。
　　3.2 各組幼魚腦組織SOD水平變化
　　與正常對照組相比，H/R組3h SOD活力降低(P＜0.05)，處

17、理組SOD活力增加(P＜0.05)，其中0.1 ppm組上升最明顯。
　　3.3 各組幼魚腦組織MDA水平變化
　　與正常對照組相比，H/R組MDA含量在3h時升高(P＜0.05)，處理組MDA含量也升高，但與H/R組無顯著差異(P＞0.05)。
　　4.各組幼魚腦組織SODmRNA表達水平變化
　　與正常對照組相比，H/R組在3h時SOD表達下調(diào)(P＜0.05)，各處理組在3h時SOD表達明顯上調(diào)(P＜0.05