1、補體是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抗感染免疫等方面發(fā)揮著十分重要的作用。在生理情況下，補體成分是以無活性的酶前體形式存在的，在某些啟動因素影響下可被依次活化產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)而發(fā)揮作用。目前，有關(guān)補體與腸炎、腫瘤關(guān)系的研究較多，在與腸炎關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，補體存在時炎癥會加重，而補體缺失炎癥則會減輕，這證實補體能促進腸炎的發(fā)展;但在與腫瘤關(guān)系的研究中，情況卻較為復(fù)雜，部分實驗結(jié)果證實補體能抑制腫瘤的生長，而另一些實驗結(jié)果則

2、發(fā)現(xiàn)補體能促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種病因不明、病程周期長的慢性腸道炎癥性疾病，由于缺乏有效治療，病情常遷延不愈。潰瘍性結(jié)腸炎最嚴重的并發(fā)癥是腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(Colitis-associated coiorectal cancer,CAC)，隨著患病時間的延長，潰瘍性結(jié)腸炎癌變的幾率逐步增高，據(jù)統(tǒng)計，約有15％的患者死于癌變。
　　補體與腸炎、腸道腫瘤的發(fā)生

3、均相關(guān)，但在腸炎向腸癌轉(zhuǎn)變過程中的作用，目前國內(nèi)外卻鮮有報道。在這一過程中，補體是否起作用、起著什么樣的作用、作用的機制如何，均是值得探討的問題。
　　目的：探討補體在UC癌變中的作用及機制，為將來可能的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：1.以氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)和葡聚糖硫酸鈉(dextransulfate sodium, DSS)聯(lián)用的方法建立CAC小鼠模型:AOM單次腹腔注射，劑量為10

4、mg/kg/只;5天后予以DSS溶液口服，濃度為1.5％，連服7天，然后換服清水14天，總計21天為一個周期，共三周期。單用DSS建立急性腸炎小鼠模型:予以DSS溶液口服，濃度3％，連服5天，然后換服清水5天。
　　2.分別在建模的第0天、20天、40天、60天和第100天檢測小鼠補體活化的指標:用定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitativepolymerase chain reaction，qPCR)檢測小鼠腸道勻漿中C3、C5、

5、C3aR、C5aR的mRNA表達水平;用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測小鼠腸培養(yǎng)上清C3a、C5a的表達水平;用免疫組化的方法檢測小鼠腸道補體的水平。
　　3.觀察活化補體在小鼠CAC模型中的作用:用腸道腫瘤計數(shù)及病理細胞學方法對比觀察補體缺失小鼠CAC模型（C3、C5、C5aR敲除）和野生型小鼠成瘤率的差異。
　　4.明確補體在UC癌變中的作用機制:

6、用病理細胞學、免疫組化及熒光激活細胞分選系統(tǒng)(Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)檢測腸道細胞浸潤情況，同時檢測急性腸炎模型的腸道通透性和菌群移位情況，明確浸潤細胞與腸道通透性、腸道菌群移位的關(guān)系;qPCR、ELISA檢測腸道浸潤的細胞群所表達的細胞因子，同時通過體內(nèi)外實驗明確細胞群之間、細胞因子之間的關(guān)系以及它們與補體的關(guān)系;用免疫組化及western blotting檢測CAC模型腸道上

7、皮增殖、凋亡情況及相關(guān)的信號通路，并明確它們和細胞因子之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：1.無論是在急性模型還是在慢性模型的建模過程中，小鼠均出現(xiàn)了腹瀉、便血、體重下降等腸炎癥狀，建模結(jié)束后的腸道病理顯示:急性腸炎小鼠腸道明顯充血、水腫，腸上皮可見糜爛、潰瘍病灶，并有大量的炎性細胞浸潤;CAC模型小鼠除上述改變外，還可見腸道有多個結(jié)節(jié)狀腫瘤，鏡下觀察細胞異型增生明顯，核漿比失調(diào)，腺管排列紊亂，腸上皮正常組織結(jié)構(gòu)被破壞，提示建模成功。

8、　　2.與對照組相比，模型小鼠從建模20天起就出現(xiàn)了補體C3、C5、C3aR、C5aR及補體活化產(chǎn)物C3a、C5a的表達升高，在建模40天、60天及100天時，上述指標逐步升高。僅C5a的表達水平在20天、40天時升高，其后降低，這是因為當C5a過度表達時，會和細胞膜表面的C5aR結(jié)合而被轉(zhuǎn)入到細胞內(nèi)導(dǎo)致其胞外濃度減低，即C5a的內(nèi)化作用。這些結(jié)果顯示，在UC癌變的過程中，補體是持續(xù)活化的，且活化水平逐步增高。
　　3.與野生型小

9、鼠相比，無論是補體C3、C5還是C5aR缺失的小鼠，其成瘤率都明顯減低，提示在UC癌變過程中，補體不僅持續(xù)活化，且活化的補體發(fā)揮了促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。
　　4.與野生型CAC小鼠相比，補體缺失小鼠CAC模型中的腸道白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素17A(Interleukin-17A，IL-17A)和白細胞介素22(Interleukin-22，IL-22)水平顯著降低，而一些常見的與腸

10、炎、腸癌發(fā)展關(guān)系密切的因子如白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α)、干擾素γ(Interferon gamma，IFNγ)等卻沒有明顯的變化，提示在UC癌變的過程中，活化補體主要是通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-17A和IL-22的表達水平而影響了腫瘤的發(fā)生。同時，補體缺失的小鼠模型腸道中的中性粒細胞浸潤顯著減少;在通常情況下，中性粒細胞聚集的最

11、大誘因是細菌及其代謝產(chǎn)物，而在腸道中存在著大量的菌群，那中性粒細胞的聚集是否和這些菌群相關(guān)呢？由于正常腸道粘膜有屏障作用，菌群不能進入腸上皮層中，補體是否通過影響腸道通透性進而導(dǎo)致腸道菌群移位而引起了中性粒細胞的聚集呢？通過檢測急性腸炎模型發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，無論補體缺失與否，急性腸炎模型的腸道通透性都是明顯增加的，腸道菌群移位也是存在的，但補體缺失的急性腸炎模型和野生型急性腸炎模型相比，腸道通透性和腸道菌群移位卻沒有差異，提示補體不

12、是通過這條途徑引起中性粒細胞浸潤的。進一步的檢測發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞表達C5aR，可與C5a相結(jié)合，而C5a的趨化作用及免疫調(diào)節(jié)作用均是過敏毒素中最強的，說明活化補體是通過C5a引起了中性粒細胞在腸道的聚集。腸上皮qPCR、ELISA的結(jié)果顯示，IL-1β主要是由腸道中性粒細胞表達的，而當補體缺失時不僅浸潤的中性粒細胞數(shù)量明顯減少，其表達IL-1β的能力也明顯下降;IL-17A則主要是由腸道CD11b+的髓系細胞表達的，當補體缺失時，這群細

13、胞的數(shù)量也是明顯減低的，表達IL-17A的能力也明顯減弱。體外實驗發(fā)現(xiàn)，用IL-1β刺激髓系細胞，能上調(diào)IL-17A的表達，而阻斷了IL-1β的作用后，IL-17A的表達下降;將不同來源的中性粒細胞與髓系細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)野生型CAC模型鼠的中性粒細胞能明顯促進髓系細胞上調(diào)IL-17A的表達，而補體缺失CAC模型鼠中性粒細胞的刺激效果較差;體內(nèi)試驗中，分別在CAC模型中敲低[用白細胞介素-1受體拮抗劑(Interleuekin-1 rec

14、eptor antagonist，IL-1Ra)模擬敲低的效果]和過表達IL-1β來檢測IL-17A的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低了IL-1β后，IL-17A的表達水平明顯減低，而過表達IL-1β后，IL-17A的水平明顯升高。這些結(jié)果都提示:在UC癌變過程中，IL-1β調(diào)節(jié)了IL-17A的表達，結(jié)合前面的實驗結(jié)果，說明活化補體能通過中性粒細胞分泌IL-1β來調(diào)節(jié)髓系細胞表達IL-17A的水平，即存在著IL-1β/IL-17A調(diào)節(jié)軸。用IL

15、-17A刺激腸腫瘤細胞系CT26，發(fā)現(xiàn)它能促進細胞增殖，且其作用與IL-17A濃度呈正相關(guān)。免疫組化及western blotting的結(jié)果顯示:當補體缺失時，腸上皮信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activatorof transcription3，stat3)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB) p65磷酸化水平明顯減低，進而引起CAC模型鼠腸道上皮凋亡增