1、背景和目的:
　　蛛網(wǎng)膜下腔出(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)是臨床最常見的腦血管危急重癥之一，主要為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致。隨著神經(jīng)影像和顯微手術(shù)的進(jìn)步，動(dòng)脈瘤破裂出血造成的直接死亡率明顯下降，但患者預(yù)后不佳，接近50％的幸存者伴有肢體癱瘓、情感或記憶障礙、喪失重新工作和生活自理能力。因此，針對SAH后繼發(fā)腦損傷的防治變得愈發(fā)重要，成為降低致死致殘率和改善患者預(yù)后的重要因素和研究熱點(diǎn)。
　　SAH后繼

2、發(fā)性腦損傷的機(jī)制至今尚未完全闡述清楚。既往研究均著眼于SAH后大血管痙攣上，認(rèn)為顱內(nèi)大動(dòng)脈痙攣是SAH后最嚴(yán)重的并發(fā)癥。該認(rèn)識(shí)來源于SAH患者的腦血管造影顯示其存在顱內(nèi)大動(dòng)脈（大于200μm）的縮窄，而SAH患者又會(huì)同時(shí)出現(xiàn)無法解釋的缺血性神經(jīng)損傷樣癥狀。因此，血管一直以來被認(rèn)為是引起SAH患者死亡或致殘的主要原因。然而，近年來其與SAH后繼發(fā)性神經(jīng)功能障礙的關(guān)系備受質(zhì)疑。一項(xiàng)應(yīng)用選擇性內(nèi)皮素A受體拮抗劑Clazosentan來治療SA

3、H患者的多中心、隨機(jī)、安慰劑對照、雙盲的臨床研究結(jié)果顯示: Clazosentan能夠顯著逆轉(zhuǎn)腦血管造影所示的血管痙攣，但并不能改善SAH患者的神經(jīng)功能預(yù)后。事實(shí)上，在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起SAH的同時(shí)，繼發(fā)性腦損傷就已經(jīng)開始發(fā)生了。動(dòng)脈瘤破裂的瞬間，顱內(nèi)壓極速升高，甚至達(dá)到與動(dòng)脈收縮壓相同的程度。因此，SAH患者最常見的主訴是“一生中從未有過的劇烈頭痛”。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SAH后10分鐘內(nèi)，興奮性氨基酸釋放、神經(jīng)元凋亡、細(xì)胞壞死等病理生理過

4、程已被激活?；谏鲜雠R床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，美國John H.Zhang教授將發(fā)生在SAH后最初72小時(shí)內(nèi)的腦損傷定義為早期腦損傷(EarlyBrain Injury，EBI)，認(rèn)為早期腦損傷是影響SAH患者急性期死亡和幸存者后期神經(jīng)功能缺損的重要因素，也是影響遲發(fā)性血管痙攣的重要因素，對早期腦損傷進(jìn)行干預(yù)可明顯提高患者生存率和預(yù)后。
　　然而，近年來單純針對神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)的臨床試驗(yàn)均告失敗，促使大家在繼續(xù)研究SAH后神經(jīng)元損傷的同時(shí)

5、，愈加重視顱內(nèi)各種細(xì)胞之間的廣泛聯(lián)系——血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Vascular Neural Network）。該結(jié)構(gòu)包括:內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)元以及與之直接相關(guān)的毛細(xì)血管、血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮與管周神經(jīng)纖維聯(lián)系、顱內(nèi)微循環(huán)及其上下游小動(dòng)靜脈。由于該結(jié)構(gòu)中各種細(xì)胞之間存在簡單、快速的交流影響機(jī)制，所以保護(hù)該網(wǎng)絡(luò)中的其他結(jié)構(gòu)與保護(hù)神經(jīng)元同樣重要。血腦屏障(BloodBrain Barrier，BBB)是該網(wǎng)絡(luò)中最具代表性的神經(jīng)

6、血管單元(Neurovascular Unit)，主要由內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞、基膜、以及周細(xì)胞等組成，最終構(gòu)成一個(gè)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞屏障，維持腦組織內(nèi)離子、激素和遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受損傷。臨床上，SAH早期即可產(chǎn)生廣泛的全腦水腫，與血腦屏障損傷導(dǎo)致的血管源性水腫密切相關(guān)，是導(dǎo)致SAH患者早期腦損傷和不良預(yù)后的主要因素之一。既往研究證實(shí)，血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中毋庸置疑的存在著血腦屏

7、障自我修復(fù)機(jī)制;因此，針對SAH早期血腦屏障損傷的修復(fù)，可能成為未來SAH等多種急性神經(jīng)損傷疾病的可靠治療靶點(diǎn)。
　　因此，本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，針對SAH后血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn):神經(jīng)元和血腦屏障，分別進(jìn)行干預(yù)，探討SAH后早期腦損傷的內(nèi)在病理生理機(jī)制，為臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。此外，本研究擬進(jìn)一步探索顱內(nèi)微循環(huán)下游靜脈系統(tǒng)在SAH后早期腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用，豐富早期腦損傷理論，為臨床SAH患者救治提供可靠的新思路。
　　

8、材料與方法:
　　1、采用大腦中動(dòng)脈線穿法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。
　　2、采用BPV(pic)(0.2 mg/kg)對SAH模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而評價(jià)其神經(jīng)功能障礙、腦含水量、伊文氏藍(lán)滲出量、海馬神經(jīng)元死亡情況、以及谷氨酸AMPA受體亞基變化。
　　3、在SAH術(shù)前48小時(shí)側(cè)腦室注射Frizzled4siRNA，SAH術(shù)后3小時(shí)側(cè)腦室注射重組Norrin蛋白，進(jìn)而評價(jià)SAH出血量、神經(jīng)功能障礙、腦含水量、伊文氏藍(lán)

9、滲出量，并用Western Blot和免疫熒光染色檢測Norrin及其受體、以及調(diào)節(jié)蛋白TSPAN12在調(diào)控血腦屏障連接蛋白中的分子作用機(jī)制。
　　4、利用腦組織體積、腦組織內(nèi)血液含量等指標(biāo)評價(jià)SAH后大腦血液循環(huán)淤積情況，并在SAH模型的基礎(chǔ)上，觀察皮層引流靜脈和頸內(nèi)靜脈回流障礙對SAH后腦組織的影響。
　　結(jié)果:
　　1、在SAH后，作為PTEN活性標(biāo)志的PTEN-ser380去磷酸化水平，能夠被BPV(pic)療

10、法顯著抑制;同時(shí)，PTEN蛋白表達(dá)水平較SAH+Vehicle組亦顯著下降。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)BPV(pic)療法能夠顯著改善神經(jīng)功能預(yù)后，對SAH后早期腦損傷的各種急性病例改變起保護(hù)作用，包括血腦屏障破壞、腦水腫、神經(jīng)元死亡等。這些神經(jīng)保護(hù)作用于谷氨酸AMPA受體亞基調(diào)控相關(guān)。具體來說，BPV(pic)治療后細(xì)胞膜上谷氨酸GluR1亞基蛋白表達(dá)下降，谷氨酸GluR2亞基和谷氨酸GluR3亞基蛋白表達(dá)水平升高。這些結(jié)果顯示: BPV(pic)

11、通過抑制PTEN對SAH后早期腦損傷起到了保護(hù)作用。
　　2、SAH后內(nèi)源性Norrin蛋白在腦組織中顯著增高，波峰分別在SAH后12小時(shí)及72小時(shí)。同時(shí)，Norrin蛋白發(fā)揮作用的一個(gè)支持蛋白TSPAN12也在SAH后顯著增高，并持續(xù)到SAH后72小時(shí)。重組Norrin蛋白能夠顯著改善SAH后神經(jīng)功能缺損和血腦屏障的破壞，這些神經(jīng)保護(hù)作用與其促進(jìn)β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，以及上調(diào)Occludin，VE-cadhe

12、rin和ZO-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用小干擾RNA抑制其受體Frizzled4受體可以逆轉(zhuǎn)重組Norrin蛋白療法的這些保護(hù)作用;表現(xiàn)為阻礙B-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位并降低Occludin，VE-cadherin和ZO-1蛋白表達(dá)水平。綜合分析后我們認(rèn)為Norrin對于SAH后血腦屏障損傷起到了保護(hù)作用。
　　3、在SAH后24小時(shí)，血管破裂同側(cè)大腦半球（左側(cè)半球）較右側(cè)大腦半球顯著腫脹，且左側(cè)大腦半球內(nèi)血液含量

13、較假手術(shù)組顯著升高，而右側(cè)大腦半球與假手術(shù)組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分析顯示:左側(cè)大腦半球含血量與腫脹比例呈正相關(guān)關(guān)系，與大鼠改良Garcia神經(jīng)功能評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與SAH出血量評分無直接相關(guān)關(guān)系。皮層引流靜脈阻斷后，SAH模型大鼠對應(yīng)引流皮層局部發(fā)生明顯充血腫脹，而頸內(nèi)靜脈結(jié)扎后可見靜脈引流區(qū)域微小靜脈較SAH組顯著怒張。
　　結(jié)論:
　　1、BPV(pic)療法能夠減輕SAH后早期腦損傷程度，該作用是通過抑制PTEN

14、進(jìn)而調(diào)控谷氨酸AMPA亞基所發(fā)揮的。基于BPV(pic)療法在低濃度下具有高選擇性和高效性，能夠顯著避免毒副作用，它可能會(huì)成為治療SAH患者早期腦損傷的一個(gè)可靠治療方法。
　　2、SAH后腦組織中內(nèi)源性Norrin蛋白顯著增高;外源性重組Norrin療法能夠保護(hù)血腦屏障完整性并改善神經(jīng)功能預(yù)后，其機(jī)制可能與Frizzled4受體介導(dǎo)的β-catenin核轉(zhuǎn)位并進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間隙蛋白表達(dá)有關(guān)。因此，重組Norrin療法有可能成為

15、改善SAH患者血腦屏障功能的可靠的新選擇。
　　3、SAH后腦組織存在循環(huán)血流量淤積，損傷同側(cè)大腦半球更為顯著;頸部大靜脈和皮層引流小靜脈回流障礙會(huì)加重SAH后腦組織腫脹，進(jìn)而加重早期腦損傷和神經(jīng)功能預(yù)后。因此，恢復(fù)SAH后動(dòng)靜脈系統(tǒng)平衡，對于緩解早期腦損傷至關(guān)重要。
　　4、血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對于維持腦組織穩(wěn)態(tài)起到了關(guān)鍵的作用，SAH后針對血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的病理生理改變進(jìn)行針對性保護(hù)，可以顯著減輕早期腦損傷，并最終改善患者預(yù)后?；?/p>