1、非病毒載體因?yàn)榘踩院?、操作?jiǎn)便、免疫原性低等方面而優(yōu)于病毒載體。但是較低的轉(zhuǎn)染效率和治療基因的短暫表達(dá)嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。我室構(gòu)建的人核糖體區(qū)打靶載體pHrneo，可以高效定點(diǎn)整合到rDNA區(qū)（定點(diǎn)整合率10-5-10-4）而使外源基因得到長(zhǎng)期的表達(dá)。人皮膚成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblast，HDF）因?yàn)橐子诓僮骱团囵B(yǎng)而成為ex vivo基因治療策略中的理想靶細(xì)胞，但是較低的轉(zhuǎn)染效率，限制了其在臨床基因治療研

2、究中的應(yīng)用。當(dāng)質(zhì)粒較大時(shí)（一般超過10kb，MW>700KD），其在細(xì)胞質(zhì)中被阻滯的時(shí)間就會(huì)越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染率也會(huì)迅速下降。攜帶治療基因的重組pHrneo質(zhì)粒一般為10-16kb，細(xì)胞質(zhì)及核膜的阻滯作用是其轉(zhuǎn)染效率低下的重要原因。 目的：為提高人核糖體區(qū)打靶載體的轉(zhuǎn)染效率，我們采用了兩種策略促進(jìn)質(zhì)粒DNA（pDNA）進(jìn)入細(xì)胞核，以降低細(xì)胞質(zhì)及核膜阻滯對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響：1）核定位信號(hào)（nuclear location signal，N

3、LS）促進(jìn)質(zhì)粒DNA快速進(jìn)入細(xì)胞核，使其在被細(xì)胞質(zhì)中核酸酶降解之前得以表達(dá)，從而達(dá)到提高轉(zhuǎn)染效率的目的；2）兩親性小分子可以干擾核孔復(fù)合體的疏水結(jié)構(gòu)，從而打破核膜障礙，促進(jìn)質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞核，提高轉(zhuǎn)染效率。 方法：1）：利用NLS與重組pHrneo質(zhì)粒通過靜電作用結(jié)合，0.6％瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)偶聯(lián)效果；DNase I模擬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核酸酶酶切，評(píng)價(jià)NLS對(duì)pDNA的保護(hù)作用；不同偶聯(lián)比例的NLS/pHrnGFP復(fù)合物利用

4、聚乙烯亞胺（PEI）法轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞，48小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)效率；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記pHrnGFP后1小時(shí)，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)質(zhì)粒的亞細(xì)胞位置。2）DMSO預(yù)處理HDF后Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pHrnGFP，24小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)效率；流式細(xì)胞儀分析DMSO處理對(duì)HDF的細(xì)胞周期的影響；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記pHrnGFP后30分鐘，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)質(zhì)粒的亞細(xì)胞位置。MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)NLS及DMSO

5、對(duì)HDF的細(xì)胞毒性。 結(jié)果：1）瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)顯示NLS與pDNA偶聯(lián)后可以降低其在凝膠中的遷移速度；當(dāng)NLS/pHrnGFP偶聯(lián)比例大于2×104時(shí)，可以在一定程度上防止DNase I的降解，并顯著提高人核糖體區(qū)打靶載體pHrnGFP的轉(zhuǎn)染效率4-5倍。激光共聚焦顯微鏡觀察NLS可以促進(jìn)pHrnGFP在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核。2）應(yīng)用2％DMSO預(yù)處理HDF48小時(shí)后，再采用Lipofectamine2000法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可以顯著

6、提高pHrnGFP的轉(zhuǎn)染效率2-3倍；DMSO處理后90％的HDF阻滯在G1期，除去DMSO后HDF繼續(xù)增殖；激光共聚焦顯微鏡下觀察，pHrnGFP可以在30分鐘內(nèi)進(jìn)入DMSO處理細(xì)胞的細(xì)胞核。 結(jié)論：NLS可以促進(jìn)人核糖體區(qū)打靶載體快速進(jìn)入細(xì)胞核，并顯著提高核糖體區(qū)打靶載體轉(zhuǎn)染HDF的效率。應(yīng)用2％ DMSO預(yù)處理HDF48小時(shí)，可以有效干擾核孔復(fù)合體的疏水結(jié)構(gòu)，顯著提高核糖體區(qū)打靶載體的轉(zhuǎn)染效率。兩種方法為核糖體區(qū)打靶載體