1、研究目的
　　動脈粥樣硬化引發(fā)的急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndromes，ACS)，即不穩(wěn)定性心絞痛(unstableangina)和急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)一直是發(fā)達國家以及某些發(fā)展中國家的首要致死和致殘疾病。據統(tǒng)計，每年全球有超過1900萬人罹患突然的冠狀動脈疾?。ˋCS或者猝死），而大部分人事先并無缺血性心臟病等征兆。在我國，隨著人民生活水平提高和飲食習慣

2、的改變，動脈粥樣硬化及其相關疾病的發(fā)病率也呈現逐年升高的趨勢，成為主要的死亡原因。臨床研究表明引起ACS的主要原因是冠狀動脈晚期粥樣硬化斑塊的突然破裂以及由此引發(fā)的血栓形成，而動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定是導致斑塊破裂的重要原因。因此，研究影響斑塊易損性的因素和機制，探索相應的干預方法，對ACS的防治具有重要的價值。
　　動脈粥樣硬化發(fā)生時血管壁局部的有害刺激，諸如氧化應激、毒性脂質等，可以擾亂內質網的功能，引起內皮細胞、平滑肌細胞、

3、巨噬細胞等動脈粥樣硬化相關細胞發(fā)生內質網應激(ERstress)。當ERstress發(fā)生時，內質網的未折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse，UPR)將作為一種補償機制發(fā)揮作用。然而，過度的ERstress會導致細胞凋亡，是引發(fā)動脈粥樣硬化斑塊并促進易損斑塊形成的一個重要病因。因此，阻斷內質網應激可能改善斑塊的易損性。四苯基丁酸（4-Phenylbutyricacid，PBA）作為一種化學伴侶，可以有效地緩解內質網

4、應激與UPR的過度活化。用于動脈粥樣硬化斑塊的干預措施是一種嶄新的嘗試。
　　IL-17A作為一種促炎性細胞因子，是新的T細胞亞群Th17的主要效應分子，參與多種炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展，我們和其他學者的研究都顯示，IL-17A可以促進小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成，但在斑塊不穩(wěn)定性中的作用尚不清楚。臨床資料數據發(fā)現ACS病人外周血IL-17A的水平較穩(wěn)定性心絞痛和正常人明顯升高，提示IL-17A具有促進斑塊不穩(wěn)定性的作用，但在已有的動物

5、模型研究中更加關注IL-17A對于動脈粥樣硬化斑塊生成的影響，而且相關實驗的結果尚存在沖突。我們前期的研究發(fā)現IL-17A可誘導人血管內皮細胞的凋亡，在小鼠斑塊破裂模型中，IL-17A的水平也有所升高，這提示與斑塊發(fā)生相比，IL-17A對于晚期斑塊穩(wěn)定性的影響可能更大。但IL-17A與斑塊易損性之間的具體因果關系并不清楚，針對IL-17進行抗體干預治療的效果也不明確。
　　本論文中，我們選取ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠斑

6、塊模型，研究內質網應激以及IL-17A對斑塊易損性的影響以及相關機制，并分別采用四苯基丁酸(PBA)和IL-17中和性抗體(IL-17mAb)作為干預措施，觀察它們增加斑塊穩(wěn)定性的效果和意義。為更好地理解易損斑塊的形成機制打下基礎，也為臨床預防和救治急性冠脈綜合征等急性心血管事件提供新的思路。
　　實驗方法
　　一、小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型
　　根據研究的側重點不同，我們分別采用ApoE-/-小鼠早期斑塊模型和晚期斑塊

7、模型。
　?。ㄒ唬〢poE-/-小鼠早期斑塊模型:8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)2周，隨機分為兩組:①PBA治療組，每三天一次腹腔注射PBA，100mg/kg，共注射5周，至總周齡16周;②對照組給以同等劑量PBS腹腔注射。
　?。ǘ〢poE-/-小鼠晚期斑塊模型:8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8周，確認斑塊形成后，隨機分組分別進行IL-17A與IL-17中和性抗體(IL-17mAb)干預實驗。
　　

8、IL-17A干預實驗包括:①IL-17A干預組:腹腔注射重組IL-17A，2μg/只，一周一次，注射4周;②對照組:以同等劑量的PBS替代IL-17A。
　　IL-17mAb干預實驗包括:①IL-17mAb組:腹腔注射IL-17單克隆抗體（IL-17mAb），50μg/只，一周一次，注射4周;②同型對照組:以大鼠IgG2A作為IL-17mAb同型對照。
　　二、小鼠體重及血脂水平的檢測
　　為了檢測干預措施對于小鼠一般

9、健康狀況的影響以及對脂肪代謝的影響。我們在實驗終止前稱量每只小鼠的體重。并采集外周血，用全自動生化分析儀檢測總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
　　三、免疫組化以及其他組織染色法
　　為了檢測各種干預措施對粥樣斑塊生成及易損性的影響，我們取小鼠主動脈根部進行連續(xù)組織切片，進行如下的項目檢測:①H&E染色檢測斑塊大小、面積;②油紅0檢測斑塊脂質含量;③免疫組化染色檢測斑塊局部平滑肌細胞、T細胞、巨噬細胞、p

10、-PERK、FOXP3等;④天狼星紅染色、Masson三色染色檢測膠原蛋白含量;⑤彈性纖維染色檢測彈性纖維含量;⑥原位明膠酶譜法檢測基質金屬蛋白酶(MMP)活性;⑦TUNEL染色檢測斑塊凋亡情況;⑧免疫熒光染色檢測調節(jié)性T細胞(Treg)轉錄因子FOXP3。
　　組織染色后拍照，用Image-ProPlus軟件測量斑塊面積及陽性著色區(qū)域面積，并計算陽性區(qū)域占斑塊總面積的比例進行統(tǒng)計分析。
　　四、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

11、
　　為了說明各種干預措施對體內炎癥情況的影響，我們取小鼠外周血，離心獲得血清，用ELISA的方法檢測IL-23、IL-10、TGF-β、IL-35等動脈粥樣硬化相關細胞因子水平。
　　五、實時定量PCR
　　為了更進一步檢測斑塊局部的炎癥情況，我們取實驗動物的胸腹主動脈，組織研磨破碎后抽提RNA，實時定量PCR法檢測各實驗組炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-23、IL-6以及抑炎因子I

12、L-10、TGF-β、IL-35相關亞單位和趨化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平。
　　六、Westernblot
　　為了檢測PBA體內抑制斑塊局部內質網應激的效果，我們取小鼠胸腹主動脈，組織破碎提取蛋白，用Westernblot的方法檢測內質網應激相關分子p-eIF2α、eIF2α、sXBP-1的水平。
　　七、流式細胞術
　　（一）調節(jié)性T細胞亞群的檢測
　　為了檢測PBA

13、干預后對調節(jié)性T細胞(Treg)水平的影響，我們取小鼠脾臟研磨成單細胞懸液，用PE-Cy5-CD4抗體和PE-Foxp3抗體共染。流式細胞術檢測CD4+Foxp3+雙陽性細胞占比，即為調節(jié)性T細胞亞群比例。
　?。ǘ┚奘杉毎蛲銮宄芰Φ臋z測
　　為了檢測IL-17A對巨噬細胞凋亡清除能力的影響，我們在體外做了巨噬細胞凋亡清除實驗。具體方法是以地塞米松腹腔注射誘導的小鼠凋亡胸腺細胞為靶細胞，CFSE染色后加入到小鼠腹腔巨噬

14、細胞中共同培養(yǎng)。用FITC標記的F4/80抗體標染巨噬細胞，流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測巨噬細胞中吞噬凋亡細胞的比例。
　?。ㄈ┘毎蜃游⒘繕颖径嘀笜肆魇降鞍锥考夹g(CBA)
　　為了節(jié)省血清標本、提高檢測效率，我們采用流式微量檢測技術(CBA)檢測更多的細胞因子指標。包括:IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-10等。
　　八、統(tǒng)計分析
　　用SPSS統(tǒng)計軟件進行數據，數據以

15、均值±標準差的方式表示。非配對的t檢驗法用于分析干預組與非干預組的差別，以p＜0.05作為統(tǒng)計學顯著性差異。
　　實驗結果
　　一、PBA緩解內質網應激對小鼠斑塊易損性的影響
　　1、PBA體內應用對血管局部內質網應激水平的影響
　　對于小鼠胸腹主動脈蛋白樣本的分析顯示，PBA體內應用后ERstress相關蛋白sXBP-1、p-eIF2a明顯減少。斑塊局部免疫組化的結果也顯示磷酸化PERK(p-PERK)的水平明

16、顯下降。說明PBA體內應用可以有效地緩解血管局部內質網應激的發(fā)生。
　　2、PBA干預對斑塊生成和斑塊穩(wěn)定性的影響
　　與對照組相比，PBA干預組胸腹主動脈斑塊數量減少，主動脈根部斑塊的面積也明顯下降。而且PBA干預組斑塊內的平滑肌含量升高、CD3+T細胞浸潤減少、凋亡水平明顯減少。這些指標提升斑塊穩(wěn)定性明顯增加。表明PBA治療可以有效地減少斑塊生成、增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　3、PBA干預對小鼠脂質代謝的影響
　

17、　PBA干預組與非干預組的體重及血脂水平均無明顯差異，說明PBA體內干預不影響小鼠一般健康狀況，也不影響脂肪代謝。排除了血脂改變對于斑塊產生影響的可能。
　　4、PBA治療對于細胞因子的影響
　　外周血ELISA和CBA檢測發(fā)現PBA干預組促炎性細胞因子如IL-2、IL-4、TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-23等均沒有顯著變化。抑炎性的細胞因子IL-35的水平有明顯的上升，IL-10有升高的趨勢。對于血管局部的檢測

18、也顯示同樣的結果，即促炎性細胞因子的mRNA水平沒有顯著變化，而抑炎性的IL-10以及IL-35相關亞單位EBi3、IL-12α的mRNA水平有明顯升高。這些結果均提示在PBA緩解內質網應激后可以促進抑炎因子的升高。
　　5、PBA治療對調節(jié)性T細胞的影響
　　調節(jié)性T細胞是抑炎性細胞因子IL-10、IL-35的主要來源，因此我們檢測了PBA干預對于調節(jié)性T細胞亞群的影響。流式細胞術檢測發(fā)現PBA治療組調節(jié)性T細胞亞群的占比

19、明顯升高。斑塊局部的FOXP3染色也發(fā)現PBA組FOXP3陽性數量明顯升高。這些結果證實PBA治療可以導致調節(jié)性T細胞亞群的改變，從而引起抑炎因子的升高。
　　6、新的抑炎細胞因子IL-35與動脈粥樣硬化的關系
　　在實驗中我們發(fā)現在PBA治療組新的抑炎因子IL-35的水平改變最為明顯。為了進一步研究IL-35與動脈粥樣硬化的關系，我們檢測了動物模型中IL-35的水平。我們發(fā)現隨著斑塊的形成，IL-35的水平下降明顯。這提示

20、IL-35可能抑制動脈粥樣硬化的生成，增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　二、IL-17A對小鼠斑塊易損性的影響及機制
　　1、IL-17A對晚期斑塊大小和易損性的影響
　　盡管H&E染色發(fā)現IL-17A干預組斑塊的絕對面積和斑塊占血管橫截面面積的比例較對照組均沒有明顯的改變，這說明IL-17A不影響晚期斑塊的大小。但外源性IL-17A的干預導致斑塊脂質含量增加、壞死核心占斑塊面積的比例增加、斑塊內凋亡數量增加、CD3+T細胞含量

21、增加，而且平滑肌的含量降低。這些都說明IL-17A導致斑塊的穩(wěn)定性下降。
　　2、IL-17A對小鼠體重與脂質代謝的影響
　　與對照組比較，IL-17A干預組的體重無明顯改變。外周血中TCH、TG、LDL、HDL等指標均無變化。這說明IL-17A體內應用不影響小鼠一般狀況與脂質代謝，其對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響并非通過影響脂質代謝而產生。
　　3、IL-17A對趨化因子的影響
　　為了研究IL-17A增加斑塊

22、CD3+T細胞含量的機制，我們用定量PCR的方法檢測了胸腹主動脈局部趨化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平，發(fā)現IL-17A處理組MCP-1、CXCL-10的水平明顯升高。提示IL-17A可以上調趨化因子的水平，從而增加T細胞等炎癥細胞向斑塊局部的浸潤。
　　4、IL-17A對巨噬細胞和巨噬細胞凋亡清除能力的影響
　　為了研究導致斑塊局部凋亡增多的原因，我們在體外檢測了oxLDL存在的情況下IL-1

23、7A對于巨噬細胞存活力的影響，以及IL-17A對于巨噬細胞凋亡清除能力的影響。在oxLDL存在的情況下加入IL-17A刺激48小時可以導致巨噬細胞死亡增加。對于凋亡清除能力的研究發(fā)現IL-17A可以下降巨噬細胞60分鐘時的凋亡清除能力，但對更長時間（90分鐘以后）的凋亡清除能力沒有影響。由此可見，在斑塊局部IL-17A可能降低巨噬細胞凋亡清除能力。更重要的是IL-17A與毒性脂質(oxLDL)的共同作用可以導致巨噬細胞死亡，從而減少巨噬

24、細胞的含量，影響凋亡細胞的及時清除，導致斑塊局部凋亡數量增加。
　　5、IL-17抗體(IL-17mAb)對晚期斑塊易損性的影響
　　為了反向驗證IL-17A對于斑塊穩(wěn)定性的影響，也為了觀察IL-17抗體干預治療的效果，我們設計了IL-17阻斷性抗體治療及其同型對照的實驗組。與預期結果相符，IL-17mAb沒有改變晚期斑塊的大小但導致斑塊內平滑肌的含量上升和CD3+T細胞水平下降。這些指標均表明應用抗體治療后可以有效地增加斑

25、塊穩(wěn)定性。具有積極的治療意義。
　　結論
　　一、PBA干預可以有效地緩解內質網應激，減少動脈粥樣硬化斑塊的生成并促進斑塊的穩(wěn)定。這一作用可能通過增加調節(jié)性T細胞含量，上調免疫負調控因子(IL-10、IL-35)的方式實現。
　　二、IL-17A不影響晚期斑塊的大小，但降低斑塊的穩(wěn)定性。IL-17A誘導的巨噬細胞死亡和巨噬細胞凋亡清除能力的降低可能是重要的機制。
　　三、IL-17中和性抗體治療可增加斑塊穩(wěn)定性。

26、
　　創(chuàng)新性與意義
　　1、發(fā)現PBA不僅能夠緩解內質網應激，而且可以上調調節(jié)性T細胞和抑制性細胞因子水平，減少動脈粥樣硬化斑塊的生成和斑塊易損性。并在小鼠模型中發(fā)現IL-35與動脈粥樣硬化疾病的關系。這些發(fā)現將有助于更好地理解此類疾病的發(fā)生發(fā)展機制，為以PBA等類似藥物用于臨床治療提供了實驗依據。
　　2、發(fā)現IL-17A對于晚期斑塊易損性的影響以及阻斷IL-17的積極作用。發(fā)現與斑塊形成相比，IL-17A對于斑塊易