1、背景：
　　結腸癌(Colon Cancer)是目前威脅人類生命健康的最嚴重疾病之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中高居第二位，致死率則排在第三位。近年來在我國結腸癌的發(fā)病率和死亡率均逐年升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。在年齡段為40-50歲之間發(fā)病率最高，結腸癌具有極強的浸潤和遠端轉移能力，其最為常見的轉移部位是肝臟。當前結腸癌最為流行的治療方法是進行手術切除，但由于中晚期患者腫瘤發(fā)生廣泛的浸潤，手術治療無法進行大面積切除，且容易形成較大創(chuàng)面

2、，則需要通過化學治療的手段來緩解癥狀并延長患者的存活時間。上世紀80年代，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）開始用于結腸癌的臨床化學治療，直到1999年，5-Fu聯(lián)合甲酰四氫葉酸的方法成為結腸癌臨床化療的最重要方案。本世紀初，5-Fu聯(lián)合一系列其它化療藥物進行結腸癌臨床治療逐漸代替了單藥療法，并沿用至今。然而，隨著化療時間延長，所需化療藥物的劑量也不斷增加，另外，化療藥物本身具有極強的毒副作用，高濃度的化療藥物將對病

3、灶所在器官和周圍臟器造成嚴重的損傷。因此，有必要明確腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，并在原有化療方案的基礎上研制對腫瘤靶向性較強，毒性作用較弱的藥物，以期在根源上遏制腫瘤的發(fā)展，使結腸癌患者生命得以延長，同時顯著改善其生存質量。
　　腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是腫瘤細胞的一部分，在腫瘤細胞中占比極小，但具有極強的增殖分化和運動能力，遠遠超過了普通腫瘤細胞，是造成腫瘤發(fā)生復發(fā)和遠端轉移的根本原因。腫瘤干細胞理論的

4、提出來源于胚胎干細胞，目前，許多研究者已在乳腺腫瘤、腦腫瘤等多種人體惡性腫瘤組織中分離并培養(yǎng)出腫瘤干細胞，經研究并反復論證發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞是腫瘤生長和發(fā)展的源泉。傳統(tǒng)的化學療法在初期可對腫瘤的生長產生抑制作用，一旦該抑制作用達到一定程度，觸及了腫瘤干細胞，則極有可能激活其干性，從而加速腫瘤的增殖分化，最終導致腫瘤發(fā)生增殖、分化和轉移。雖然腫瘤干細胞數(shù)量極少，但其致瘤能力是普通腫瘤細胞的數(shù)百倍，這從根本上導致腫瘤難以被徹底清除。因此，基于

5、腫瘤干細胞理論，研究人員有必要明確腫瘤干細胞的特性，存活區(qū)域以及致瘤機制，以便從根源遏制腫瘤的發(fā)展。
　　上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是指在胚胎發(fā)育、炎癥反應、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中，上皮細胞經過特定的過程，向間質細胞轉化，并具有間質細胞的特性。尤其在腫瘤發(fā)展過程中，上皮間質轉化被認為是腫瘤干細胞所具備的最重要的特性之一，腫瘤干細胞極強的侵襲轉移能力即是通過上皮間質轉化實

6、現(xiàn)的。該過程具有以下特點:1、粘附分子E-cadherin功能缺失，細胞間的緊密連接逐漸消失，導致腫瘤細胞運動能力增強;2、細胞角蛋白發(fā)生形態(tài)學變化轉化為波形蛋白(Vimentin)，使細胞具有間質細胞的形態(tài)學特征;3、在粘附分子表達受到抑制的同時，轉錄因子Twist表達發(fā)生上調，Snail因子，尤其是Snail1和Snail2因子表達明顯是EMT發(fā)生的重要標志。因此，上皮間質轉化是腫瘤發(fā)生遠端轉移和復發(fā)的重要過程，為了抑制該過程，就需

7、致力于在臨床一線化療藥物的基礎上，研發(fā)新的可靶向腫瘤干細胞，抑制腫瘤干細胞發(fā)生上皮間質轉化的化療藥物。
　　普朗尼克（Pluronic）是由兩個聚氧化乙烯鏈和一個聚氧化丙烯鏈構成的三嵌段聚合物納米材料(PEO-PPO-PEO)，在水中可自發(fā)形成環(huán)狀共聚物膠束，當聚合物濃度高于臨界膠束濃度（Critical Micelle Concentration，CMC）時，該聚合物在水中可進行首尾相接形成球形膠束結構。其中，聚氧化丙烯鏈具有疏

8、水性特征，可作為膠束的內核，與所包裹的藥物直接接觸;聚氧化乙烯鏈具有親水性特征，可與水相接觸，形成膠束的外殼。由普朗尼克自發(fā)聚合形成的膠束，不僅具有普通膠束所具備的一切特性，如增溶、延長藥物作用時間和靶向性等，更重要的是，其在體內可分解形成小分子，能夠顯著抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的合成，可在一定程度上降低腫瘤細胞的耐藥性。在許多科學研究中，普朗尼克被譽為最有前途的臨床化療藥物載體之一，將被廣泛應用于抗腫瘤

9、藥物的載體研究。根據在常溫下普朗尼克的狀態(tài)差異，其大致可分為三種類型，分別為L:液體，P:糊狀，F(xiàn):固體，再根據普朗尼克聚合物長度的不同，普朗尼克可被分為多種類型，如L61、F127、P407等。許多研究表明，無論是普朗尼克的形狀、安全性，還是其增強藥物敏感性方面，普朗尼克P85相對于L61等其它分支，都具有明顯的優(yōu)勢。
　　鑒于以上理論及背景，本課題組在課題設計初期提出假設:是否可使普朗尼克P85與結腸癌臨床一線化療藥物5-氟尿

10、嘧啶應用物理、化學方法進行結合，形成5-Fu/P85共聚物膠束，從而靶向腫瘤干細胞、抑制腫瘤干細胞的EMT進程、控制腫瘤干細胞的比例，最終達到抑制腫瘤生長和轉移的目的。
　　目的：
　　本課題旨在明確結腸癌發(fā)生肝臟轉移的發(fā)生機制，在原有化療藥物的基礎上采用物理、化學方法得到共聚物膠束，以期從根源上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為指導臨床治療結腸癌發(fā)生遠端轉移提供新思路、新方向。
　　方法：
　　1.采用薄膜水化法制備了三嵌

11、段共聚物普朗尼克P85與化療藥物5-氟尿嘧啶形成共聚物膠束，得到兩種不同濃度的共聚物膠束，分別用于體內和體外實驗的研究。
　　2.選取人的結腸癌細胞系HCT116作為實驗對象，運用劃痕實驗、細胞克隆形成實驗和CCK-8實驗等方法，在體外探討5-Fu/P85共聚物膠束是否可抑制腫瘤細胞的生長和增殖。
　　3.將結腸癌細胞系HCT116接種于Balb/c裸鼠脾臟，建立結腸癌肝臟轉移小鼠模型，經尾靜脈注射給藥后，觀察5-Fu/P8

12、5共聚物膠束是否可在體內抑制小鼠肝臟轉移瘤的發(fā)生及生長。
　　4.經對小鼠肝功能指標白蛋白和谷丙轉氨酶的檢測及對其存活時間的觀察，確定5-Fu/P85共聚物膠束是否可在一定程度上減輕化療藥物的毒副作用，延長小鼠的存活時間，提高其生存質量。
　　5.采用細胞克隆形成實驗及流式細胞儀檢測經5-Fu/P85共聚物膠束干擾后的HCT116細胞中，CD133+CXCR4+細胞比例是否降低，從而確定5-Fu/P85共聚物膠束是否具有靶向

13、腫瘤干細胞并殺傷腫瘤干細胞的作用。
　　6.在體外細胞實驗和小鼠體內實驗中，分別采用Transwell侵襲轉移、Realtime-PCR、免疫熒光染色和免疫組織化學染色等實驗方法，通過對上皮間質轉化(EMT)相關基因表達變化的檢測，揭示5-Fu/P85共聚物膠束抑制結腸癌肝臟轉移的作用機制。
　　結果：
　　1.在體外，5-Fu/P85共聚物膠束可顯著抑制人結腸癌細胞系HCT116的增殖和克隆形成能力;在體內，5-Fu

14、/P85共聚物膠束可明顯抑制結腸癌肝臟轉移瘤的大小并降低其惡性程度，降低化療藥物的毒副作用，延長小鼠的存活時間。
　　2.5-Fu/P85共聚物膠束可抑制結腸癌細胞系HCT116細胞中CD133+CXCR4+細胞的比例。
　　3.5-Fu/P85共聚物膠束可在一定程度上抑制結腸癌細胞系HCT116細胞中CD133+CXCR4+細胞和結腸癌肝轉移小鼠模型肝臟腫瘤發(fā)生上皮間質轉化(EMT)的進程。
　　結論：
　　經

15、薄膜水化法制備的5-氟尿嘧啶/普朗尼克P85共聚物膠束具有明顯的抗腫瘤作用，降低化療藥物5-氟尿嘧啶的給藥濃度后也可達到同樣的甚至更佳的抗腫瘤效果，明顯降低了化療藥物的毒副作用，減小肝臟及其它重要臟器受損傷風險和程度，同時可延長生命并提高生存質量。
　　經研究發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶/普朗尼克P85共聚物膠束抗腫瘤的作用機制是通過靶向結腸癌腫瘤干細胞，抑制腫瘤干細胞發(fā)生上皮間質轉化(EMT)這一進程來實現(xiàn)的。因此，5-氟尿嘧啶/普朗尼克