1、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，是引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明一種在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面發(fā)揮重要作用的小RNA-microRNA(miRNA)在HCMV感染過程中表達(dá)并發(fā)揮重要作用，受到了廣泛關(guān)注。
　　迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV至少編碼26種miRNA。研究發(fā)現(xiàn)HCMV miRNA可以調(diào)節(jié)HCM

2、V自身或宿主細(xì)胞基因的表達(dá)抑制病毒復(fù)制，從而有利于潛伏狀態(tài)的形成和長(zhǎng)期保持。另外，HCMV miRNA還可以通過靶向作用于相應(yīng)的靶基因建立免疫逃避機(jī)制，并參與宿主細(xì)胞分泌通路、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等多個(gè)過程的調(diào)控。每個(gè)miRNA可以靶向作用于多個(gè)靶基因，可能通過不同途徑發(fā)揮調(diào)控作用。對(duì)HCMV miRNA靶基因的鑒定和功能研究，將有利于在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面解釋病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，為揭示HCMV感染的致病機(jī)制提供有利的科學(xué)資料。

3、>　　本研究中我們首先檢測(cè)了HCMV miR-US25-1-5p和miR-US5-1在HCMV感染過程中的表達(dá)情況，然后篩選兩者可能調(diào)控的靶基因，并進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)和westem blot驗(yàn)證這兩個(gè)miRNA對(duì)相應(yīng)靶基因的調(diào)控作用，最后我們通過過表達(dá)miRNA或轉(zhuǎn)染相應(yīng)的小干擾RNA(small interferenceRNA，siRNA)抑制靶基因的表達(dá)，檢測(cè)它們的調(diào)控作用對(duì)宿主細(xì)胞和/或HCMV DNA復(fù)制的影響。對(duì)于揭示mi

4、R-US25-1-5p和miR-US5-1在HCMV致病過程中的生物學(xué)功能具有重要的意義。
　　第一部分 人巨細(xì)胞病毒miR-US25-1-5p靶基因的篩選和功能研究
　　目的：
　　篩選并鑒定人巨細(xì)胞病毒miR-US25-1-5p調(diào)控的靶基因，進(jìn)一步研究人巨細(xì)胞病毒miR-US25-1-5p對(duì)靶基因的調(diào)控在病毒感染中的作用。
　　方法：
　　HCMV病毒株為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床低傳

5、代分離株Han株;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測(cè)HCMV感染后不同時(shí)間點(diǎn)MRC5細(xì)胞中miRNA-US25-1-5p的表達(dá)情況;通過hybrid PCR及其衍生出的方法篩選miRNA-US25-1-5p的候選靶基因;選取靶基因中的YWHAE，UBB，HSP90AA1和NPM1作為進(jìn)一步研究的對(duì)象，將含有miRNA-US25-1-5p結(jié)合位點(diǎn)的相應(yīng)靶基因序列克隆到pMIR載體中，構(gòu)建野生型報(bào)告載體，用Site

6、-directedGene Mutagenesis試劑盒構(gòu)建含有突變位點(diǎn)的突變型報(bào)告載體，將這兩種載體分別與miRNA-US25-1-5p模擬物或miRNA陰性對(duì)照共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化以判斷miRNA-US25-1-5p與候選靶基因的結(jié)合能力;利用pBI-CMV2載體構(gòu)建靶基因表達(dá)載體pBI-YWHAE-Myc，pBI-UBB-Myc和pBI-NPM1-Myc，miRNA-US25-1-5p模擬物或miRNA陰

7、性對(duì)照單獨(dú)或與靶基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Western blot檢測(cè)靶基因蛋白水平的變化，明確miRNA-US25-1-5p對(duì)這些靶基因的調(diào)控作用。根據(jù)文獻(xiàn)合成靶基因的干擾序列，退火后插入到pSilencer4.1載體中，構(gòu)建特異性阻斷靶基因蛋白表達(dá)的小干擾表達(dá)載體。miRNA對(duì)照、miRNA-US25-1-5p模擬物、miRNA-US25-1-5p抑制劑或相應(yīng)靶基因的小干擾單獨(dú)或與相應(yīng)靶基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MRC5細(xì)胞，24

8、小時(shí)之后感染HCMV病毒，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)靶基因的蛋白水平和病毒拷貝數(shù)的變化，分析miRNA-US25-1-5p調(diào)控靶基因?qū)CMV DNA復(fù)制的影響。
　　結(jié)果：
　　1、miRNA-US25-1-5p在HCMV感染的MRC5細(xì)胞中存在表達(dá)，其表達(dá)量隨病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;
　　2、經(jīng)過hybrid PCR及其衍生出的方法篩選，共得到34個(gè)候選靶基因，所篩選到的靶基因全來(lái)源于宿主細(xì)

9、胞，熒光素酶活性檢測(cè)和western blot證實(shí)了miRNA-US25-1-5p對(duì)YWHAE，UBB，HSP90AA1和NPM1的靶向調(diào)控作用;
　　3、在HCMV感染過程中過表達(dá)miRNA-US25-1-5p或應(yīng)用特異的小干擾抑制相應(yīng)靶基因的表達(dá)可以抑制HCMV DNA復(fù)制。
　　結(jié)論：
　　miRNA-US25-1-5p在HCMV感染的MRC5細(xì)胞中高度表達(dá)，并可以靶向調(diào)控宿主基因YWHAE，UBB，HSP90A

10、A1和NPM1，miRNA-US25-1-5p對(duì)這些靶基因的調(diào)控作用可以抑制HCMV DNA復(fù)制。
　　第二部分 人巨細(xì)胞病毒miR-US5-1靶基因的篩選和功能研究
　　目的：
　　篩選并鑒定人巨細(xì)胞病毒miR-US5-1調(diào)控的靶基因，進(jìn)一步研究人巨細(xì)胞病毒miR-US5-1對(duì)靶基因的調(diào)控在病毒感染中的作用。
　　方法：
　　HCMV病毒株為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床低傳代分離株Han株

11、;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測(cè)HCMV感染后不同時(shí)間點(diǎn)U373細(xì)胞中miRNA-US5-1的表達(dá)情況。通過hybrid PCR篩選miRNA-US5-1的候選靶基因，將含有miRNA-US5-1結(jié)合位點(diǎn)的11個(gè)候選靶基因序列克隆到pMIR載體中，構(gòu)建野生型報(bào)告載體，檢測(cè)熒光素酶活性變化以判斷miRNA-US5-1與相應(yīng)靶基因的結(jié)合能力，選取與miR-US5-1結(jié)合能力較強(qiáng)的geminin(GMNN)作為進(jìn)

12、一步研究的對(duì)象，在野生型報(bào)告載體pMIR-GMNN的基礎(chǔ)上利用Site-directed Gene Mutagenesis試劑盒構(gòu)建含有突變位點(diǎn)的突變型報(bào)告載體pMIR-GMNN-MUT，將這兩個(gè)載體分別與miRNA-US5-1模擬物或miRNA陰性對(duì)照共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-US5-1與GMNN的結(jié)合作用。U373細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA陰性對(duì)照，miRNA-US5-1模擬物，miRNA-US

13、5-1模擬物和miRNA-US5-1抑制劑或GMNN特異性小干擾，western blot檢測(cè)靶基因GMNN蛋白水平的變化，明確miRNA-US5-1對(duì)GMNN的調(diào)控作用。之前有文獻(xiàn)報(bào)道GMNN在HCMV感染過程中蓄積，為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，我們利用western blot檢測(cè)了正常、HCMV自然感染及轉(zhuǎn)染miRNA-US5-1模擬物之后再感染HCMV的U373細(xì)胞中GMNN的表達(dá)情況。U373細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)照，miRNA-US5

14、-1模擬物，miRNA-US5-1抑制劑或GMNN特異性小干擾，24小時(shí)之后感染HCMV病毒，Western印跡雜交和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)GMNN的蛋白水平和病毒拷貝數(shù)的變化，分析miR-US5-1調(diào)控GMNN對(duì)HCMVDNA復(fù)制的影響。U373細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-US5-1模擬物或GMNN特異的小干擾，應(yīng)用流式細(xì)胞分析及CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖變化，分析miRNA-US5-1下調(diào)GMNN對(duì)細(xì)胞周期及增殖帶來(lái)的影響。

15、>　　結(jié)果：
　　1、miRNA-US5-1在HCMV感染的U373細(xì)胞中存在表達(dá)，其表達(dá)量隨病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;
　　2、經(jīng)過hybrid PCR篩選，共得到23個(gè)候選靶基因，所篩選到的靶基因全來(lái)源于宿主基因組，熒光素酶檢測(cè)和western blot證實(shí)了miRNA-US5-1對(duì)GMNN的靶向調(diào)控作用;
　　3、與正常細(xì)胞相比HCMV感染之后GMNN的表達(dá)量增加了，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)GMNN的表達(dá)量逐漸增加，

16、但過表達(dá)miRNA-US5-1抑制了GMNN的增加;
　　4、在HCMV感染過程中過表達(dá)miRNA-US5-1或應(yīng)用特異的小干擾抑制GMNN的內(nèi)源性表達(dá)可以抑制HCMV DNA復(fù)制;
　　5、通過過表達(dá)miRNA-US5-1或應(yīng)用特異的小干擾抑制GMNN的內(nèi)源性表達(dá)，可以影響細(xì)胞周期分布及細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞減少、進(jìn)入S和G2期細(xì)胞增加及細(xì)胞增殖增加;
　　結(jié)論：
　　miRNA-US5-1在HCMV感染的