1、凝集素廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi),具有多種生物活性,在魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育早期,各組織還未完全發(fā)育之時(shí),對(duì)外界病原體仍然有一定的抵御能力,這種抵御能力來(lái)自自身非特異性免疫和母源性免疫,而存在于卵母細(xì)胞中的凝集素等物質(zhì)被認(rèn)為是來(lái)自母體的免疫物質(zhì),并且極有可能在魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用(王志平,2008)。對(duì)母源凝集素的研究,有利于對(duì)凝集素在魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中所扮演的角色進(jìn)行深入了解,以期為魚(yú)類(lèi)免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　在本研究中,首先

2、我們克隆得到了斑馬魚(yú)母源凝集素基因zfol,cDNA全長(zhǎng)為937bp,包含一個(gè)771bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼256個(gè)氨基酸,長(zhǎng)73bp的5’非編碼區(qū)(5’-UTR,5’-untranslatedregion),長(zhǎng)93bp的3’非編碼區(qū)(3’-UTR,3’-untranslatedregion)。通過(guò)RT-PCR和western-blot對(duì)其進(jìn)行了mRNA水平和蛋白水平的時(shí)空表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)zfol在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變

3、化,在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育初期,zfolmRNA表達(dá)量較高,隨著胚胎的不斷發(fā)育,zfol的
　　mRNA表達(dá)量有所下降,到后期表達(dá)量又上升;斑馬魚(yú)成魚(yú)各組織中mRNA水平,除了精巢不表達(dá)外,在成魚(yú)肝臟、腎臟、卵巢、腦、心臟中均有表達(dá),且表達(dá)量相當(dāng)。而Zfol蛋白在卵巢中表達(dá)量最高,腎臟中也有表達(dá),但是表達(dá)量相對(duì)較低,而在肝臟、腦、精巢、心臟這些組織中均不表達(dá);在胚胎發(fā)育0到4小時(shí)時(shí)蛋白的表達(dá)量較高,6~9小時(shí)蛋白表達(dá)量下降,12~16小

4、時(shí)蛋白表達(dá)量又再上升,20~24小時(shí)下降,到36小時(shí)蛋白表達(dá)量升高,而后Zfol蛋白的表達(dá)量又下降。為了進(jìn)一步研究zfol基因在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中所扮演的角色,我們選擇基因敲除技術(shù)來(lái)研究zfol的功能,構(gòu)建zfol基因的斑馬魚(yú)突變體,在現(xiàn)有的基因敲除技術(shù)中,又以TALENs技術(shù)最具優(yōu)勢(shì),能夠?qū)δ康幕虻奶禺愋蛄羞M(jìn)行誘變,且突變率高,與其他技術(shù)相比,優(yōu)勢(shì)明顯,故在本研究中我們采用TALENs技術(shù)對(duì)zfol進(jìn)行誘變,達(dá)到敲除zfol基因的

5、目的。利用TALENs技術(shù),通過(guò)設(shè)計(jì)能夠特異性識(shí)別zfol目標(biāo)序列的TALENs,誘導(dǎo)zfol目標(biāo)序列產(chǎn)生插入或缺失突變,從而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止,起到敲除zfol基因的作用,構(gòu)建zfol的突變體。通過(guò)對(duì)zfol基因的斑馬魚(yú)突變體進(jìn)行研究,初步了解zfol在斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的功能。對(duì)zfol斑馬魚(yú)突變體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),缺失zfol后的斑馬魚(yú)發(fā)育較緩慢,同時(shí)對(duì)其表型進(jìn)行分析表明,圍心腔處有輕微膨大的現(xiàn)象,這些結(jié)果暗