1、深海是典型的高靜水壓環(huán)境,嗜壓微生物(piezophile)是深海生態(tài)系統(tǒng)中的重要類群。隨著深海取樣技術的不斷發(fā)展和深海高壓微生物特殊培養(yǎng)裝置的研發(fā),已經從深海環(huán)境中分離到了多種嗜壓微生物,其中包括不能在常壓條件下生長的專性嗜壓微生物。通過對分布于不同壓力范圍的微生物近緣種間進行比較而獲得的嗜壓微生物的壓力適應性的認識,不能反映微生物個體水平上對靜水壓力變化的應激調控機制。本文通過比較嚴格嗜壓菌株與其衍生的兼性嗜壓菌株在基因組、轉錄組及

2、相關生理性狀上的差異,試圖從微生物細胞的物質代謝與能量轉化的角度分析深海嗜壓微生物的壓力適應性。
　　Pyrococcusyayanosii CH1分離自大西洋中脊4100米水深的“Ashadze”熱液口,是目前已知的第一株和唯一一株嚴格嗜壓的超嗜熱古菌,其最適生長壓力為52 MPa,最高耐受壓力超過了120 MPa。本論文通過人工馴化手段,獲得CH1衍生的兼性嗜壓菌株A1,其最適生長壓力為52 MPa,但壓力耐受范圍變寬,可以在

3、0.1 MPa的常壓條件下生長。對A1菌株進行全基因組測序,并與CH1進行比較基因組分析,結果表明兩個基因組中存在23處序列差異,這些序列差異所在的基因主要與細胞周期調控、鞭毛的合成以及芳香族氨基酸的轉運等相關。對A1菌株中相關基因的功能展開研究,將有助于揭示此類深海超嗜熱嗜壓古菌的壓力適應性機制。
　　A1可以在常壓下生長,使以該菌株為宿主建立遺傳操作系統(tǒng)成為可能。構建了攜帶A1中pyrF基因側翼同源序列和受谷氨酸脫氫酶強啟動子

4、控制的3-hydroxy-3-methylglutaryl輔酶 A(HMG-CoA)還原酶超表達基因元件(SimR)的自殺質粒pLMO02。利用過表達HMG-CoA還原酶賦予A1菌株simvastatin抗性作為標記,成功的中斷了A1菌株的pyrF基因(PYCH0296),獲得了尿嘧啶缺陷型菌株A2。而且,又構建了SimR-pyrF基因元件,獲得了無痕基因中斷載體pLMO03。無痕敲除系統(tǒng)突破了A1菌株中可用篩選標記的限制,可以中斷A1

5、基因組中的任何非必需基因,并且篩選標記可以重復利用。
　　單一菌株以甲酸為唯一碳源的產氫呼吸途徑僅見于深海超嗜熱古菌Thermococcus onnurineus NA1,是最簡單的厭氧呼吸方式之一。比較基因組分析表明,Thermococcales科超嗜熱古菌中只有 Thermococcus onnurineus NA1、Thermococcus gammatolerans EJ3和Pyrococcusyayanosii中存在有完

6、整的甲酸代謝基因簇(Fmr)。中斷A1菌株的Fmr基因簇后,突變株中大量積累甲酸,其0.1 MPa的生長也受到限制。膜結合態(tài)氫酶復合體 Mbh以及胞質內氫酶復合體SHI參與了Thermococcales微生物的能量代謝,中斷A1菌株的Mbh和SHI基因簇后,突變株中也積累甲酸,表明Mbh和SHI復合體也參與了A1菌株的甲酸代謝。
　　甲酸既是代謝過程中的重要中間代謝產物,也是一些超嗜熱微生物肌苷(IMP)合成途徑中的一碳單元。對A

7、1菌株在0.1 MPa和52 MPa壓力條件下的轉錄組分析發(fā)現,與IMP合成途徑相關的基因轉錄在0.1 MPa壓力條件下調,而與甲酸代謝及能量轉換相關的氫酶的編碼基因則轉錄上調。該結果暗示,A1中參與IMP合成代謝的甲酸被分解產能以適應低壓的脅迫環(huán)境。而對于CH1在15 MPa和52 MPa壓力條件下的轉錄組分析發(fā)現,其在15 MPa的邊界壓力下,不能有效的調節(jié)甲酸由參與IMP合成向氧化產能轉換。
　　進一步對 IMP合成途徑和甲

8、酸氧化途徑相關基因的啟動子區(qū)域分析,發(fā)現IMP生物合成途徑中的多個基因的上游區(qū)域,存在有一個保守的 motif“CnTn5TGn3AAA”。以此 motif為探針,通過磁珠富集的方法獲得了可以與該motif結合的轉錄因子(PTF)。轉錄組和蛋白組分析結果表明,A1菌株中甲酸代謝受壓力調控的可能模型為:當A1處于52 MPa時,PTF高表達,并與IMP途徑中相關基因的motif結合,激活IMP途徑的表達。甲酸作為一碳單元,參與IMP的合成