1、目的：胰腺癌是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，患者的預(yù)后往往不佳。早期生長反應(yīng)因子3（early growth response3, EGR3）作為EGR轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，參與多種生物過程的調(diào)節(jié)，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，炎癥反應(yīng)和免疫。目前，EGR3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不確定。本研究旨在探討EGR3對胰腺癌細胞增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影響及機制，從而為胰

2、腺癌的治療提供新的思路。
　　方法：⑴EGR3對胰腺癌細胞增殖的影響及機制研究：首先，分別利用siRNA或過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Western blot）實驗在基因和蛋白水平檢測兩者的轉(zhuǎn)染效率，篩選能夠成功下調(diào)或上調(diào)細胞內(nèi)EGR3水平的siRNA或質(zhì)粒；其次，分別應(yīng)用CCK8（CCK8 assay）和平板克隆實驗（colony formation assay）檢測沉默或過表達

3、EGR3的胰腺癌細胞的增殖能力；最后，分析EGR3影響細胞增殖的分子機制。⑵EGR3對胰腺癌細胞凋亡的作用及機制研究：在本部分實驗中，我們首先分別利用流式細胞術(shù)（flow cytometry, FCM）和TUNEL實驗（TUNEL assay）檢測EGR3對胰腺癌細胞凋亡的影響；再者，分別進行qRT-PCR和Western blot實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。⑶EGR3在胰腺癌細胞EMT過程中的作用及機制研究：首先，我們應(yīng)用沉默或過

4、表達EGR3的胰腺癌細胞，觀察其形態(tài)學(xué)的改變，利用劃痕實驗（wound healing assay）、Transwell實驗（Transwell assay）檢測EGR3對胰腺癌細胞侵襲遷移能力的影響；其次，分別利用qRT-PCR、Western blot和免疫熒光（immunofluorescence）技術(shù)檢測EMT相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，以及關(guān)鍵信號通路活性的變化。⑷EGR3抑制Akt Ser473位點磷酸化的機制研究：在本部分實驗中，

5、我們分別應(yīng)用PI3K抑制劑 LY294002和 Akt抑制劑 MK-2206預(yù)處理胰腺癌細胞，隨后沉默細胞內(nèi)的EGR3，利用 CCK8實驗檢測細胞的增殖情況；然后，利用 Western blot技術(shù)檢測LY294002或MK-2206預(yù)處理后再轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA的胰腺癌細胞內(nèi)的Akt Ser473位點的磷酸化水平；最后，我們進行qRT-PCR和Western blot實驗分析EGR3對mTOR復(fù)合物2（mTORC2）的重要組分Ri

6、ctor的影響。
　　結(jié)果：①EGR3抑制胰腺癌細胞的增殖：qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示兩種EGR3 siRNA（si-EGR3-1和si-EGR3-3）均能夠明顯下調(diào)胰腺癌細胞系PANC-1及SW1990內(nèi)的EGR3表達，而EGR3過表達質(zhì)粒（EGR3-plasmid）則成功上調(diào)EGR3水平；CCK8實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果表明，沉默EGR3使PANC-1及SW1990細胞的增殖能力增強，而過表達EGR

7、3則使這兩種細胞的增殖能力減弱；Western blot實驗提示EGR3 siRNA轉(zhuǎn)染后的PANC-1及SW1990細胞內(nèi)的Ser473位點磷酸化的Akt（pAkt-Ser473）水平及其下游靶蛋白P70S6K的磷酸化水平（p-P70S6K）升高，而上調(diào)EGR3后細胞內(nèi)的pAkt-Ser473和p-P70S6K均降低。②EGR3誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡：流式細胞術(shù)及TUNEL實驗結(jié)果表明，沉默EGR3的PANC-1細胞的凋亡率下降，過表達

8、EGR3的PANC-1細胞的凋亡率則升高；qRT-PCR和Western blot實驗分別在mRNA和蛋白水平證實，沉默EGR3的PANC-1細胞內(nèi)的促凋亡因子Bax和抑凋亡因子Bcl2分別降低和上升，而上調(diào)PANC-1細胞內(nèi)的EGR3后這兩種凋亡相關(guān)蛋白則分別升高和降低。③EGR3減弱胰腺癌細胞的侵襲遷移能力，抑制細胞的EMT：用EGR3 siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細胞，在顯微鏡下觀察 PANC-1細胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)對照（si-NC

9、）組的PANC-1細胞形狀為多邊形，排列整齊，細胞間連接緊密，而EGR3 siRNA組的PANC-1細胞形狀則變得不規(guī)則，排列雜亂，細胞間隙變大；劃痕實驗結(jié)果顯示，當(dāng)PANC-1細胞內(nèi)的EGR3水平下降時，劃痕愈合加快，而EGR3上升時劃痕愈合速度則減慢；通過Transwell實驗，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)PANC-1細胞內(nèi)的EGR3水平會引起侵襲及遷移的細胞數(shù)增多，而上調(diào) EGR3則導(dǎo)致細胞數(shù)減少；在mRNA和蛋白水平檢測PANC-1細胞內(nèi)的Sl

10、ug、E-cadherin和Vimentin的表達情況，發(fā)現(xiàn)下調(diào)細胞內(nèi)的EGR3后，E-cadherin降低而Slug和Vimentin上升，當(dāng)上調(diào)細胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致相反的效果；免疫熒光結(jié)果表明，PANC-1和SW1990細胞表面的E-cadherin蛋白表達隨著EGR3的降低而降低，上升而增加；Western blot結(jié)果顯示，PANC-1細胞內(nèi)的EGR3沉默后，pAkt-Ser473和pGSK3β-Ser9的水平均升高，而EGR

11、3過表達時兩者均下降。④EGR3降低Akt Ser473位點磷酸化水平的作用可能與其抑制Rictor的表達有關(guān)：向經(jīng)過LY294002預(yù)處理過的PANC-1和SW1990細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA后，CCK8實驗結(jié)果顯示EGR3 siRNA組的細胞增殖能力仍高于si-NC組，而沉默經(jīng)過MK-2206預(yù)處理過的PANC-1及SW1990細胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致細胞的增殖能力低于si-NC組；Western blot實驗結(jié)果表明，LY29

12、4002預(yù)處理后再轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA的PANC-1和SW1990細胞內(nèi)的pAkt-Ser473和p-P70S6K的水平與si-NC組的相比仍增加，而利用MK-2206預(yù)處理細胞后，沉默兩種細胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致pAkt-Ser473的變化不明顯，同時引起p-P70S6K的水平降低；qRT-PCR和Western blot實驗證實當(dāng)PANC-1和SW1990細胞內(nèi)的EGR3降低時mTORC2的核心亞基Rictor的表達水平升高，而E

13、GR3上調(diào)時Rictor則減少。
　　結(jié)論：EGR3分別通過抑制胰腺癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、減弱細胞侵襲遷移能力和EMT這三個方面發(fā)揮抑癌作用，其可能與抑制Akt/P70S6K通路，促進促凋亡因子Bax同時降低抗凋亡因子Bcl2的表達，并且減弱Akt/GSK3β信號通路活性從而影響下游EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達有關(guān)。除此之外， EGR3對胰腺癌細胞的抗增殖作用與Akt有關(guān)，但不