1、腫瘤微環(huán)境中富含來(lái)源于免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶，比如胰蛋白酶、類胰蛋白酶等，它們可以通過(guò)選擇性地激活與G蛋白相偶聯(lián)的蛋白酶活化受體-2（Proteinase Activated Receptor2，PAR2）促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。PAR2廣泛分布于體內(nèi)外多種組織中，并在腫瘤，尤其是肺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PAR2表達(dá)增高與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，然而到目前為止，PAR2調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的分子

2、機(jī)制尚不明確。此外，miRNAs是一類重要的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常。miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)靶分子mRNA在體內(nèi)發(fā)揮原癌或抑癌基因的作用，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程。本論文探討了miR-125b介導(dǎo)PAR2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移以及PAR2信號(hào)通路在調(diào)控miR-125b表達(dá)的分子機(jī)制。
　　第一部分，我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)PAR2活化在促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞遷移的同時(shí)抑制了細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá);

3、而敲降PAR2不僅抑制了細(xì)胞遷移，而且上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)水平。此外，過(guò)表達(dá)miR-125b可以阻斷PAR2活化誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。接下來(lái)為尋找miR-125b的下游靶基因，我們利用miRNAs靶基因在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了miR-125b下游靶基因，其中有124個(gè)基因與PAR2敲降結(jié)腸癌細(xì)胞全基因組表達(dá)譜芯片中相應(yīng)基因的mRNA變化趨勢(shì)相符。進(jìn)一步縮小范圍驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn):Gab2同時(shí)受miR-125b和PAR2雙重調(diào)節(jié)。最后，利用雙熒

4、光素酶報(bào)告基因了Gab2是miR-125b的直接靶基因，并在體外證實(shí)miR-125b及其下游靶基因Gab2參與了PAR2誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移。
　　為了探尋PAR2信號(hào)通路在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用，我們先后利用小鼠的結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型及不同的腫瘤組織驗(yàn)證了PAR2、miR-125b和Gab2的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。首先我們利用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)成功建立小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型。在該模型中可以依次觀

5、察到從增生向腺瘤、腺癌發(fā)展的病理過(guò)程，尤其是到了建模的晚期，小鼠結(jié)腸腺瘤突破基底層侵入粘膜下層形成腺癌。在此過(guò)程中，PAR2表達(dá)顯著上升，而miR-125b表達(dá)則被抑制，Gab2在腺癌的表達(dá)也顯著升高。另外，臨床結(jié)直腸癌患者組織中PAR2與Gab2表達(dá)顯著高于癌旁，miR-125b則相反，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌病灶中PAR2、miR-125b及Gab2表達(dá)具有顯著相關(guān)性。上述結(jié)果在卵巢癌樣本及肺癌公共數(shù)據(jù)庫(kù)中也得到了驗(yàn)證。
　　

6、第二部分，我們深入探討了PAR2抑制miR-125b表達(dá)的分子機(jī)制。最新研究顯示，乳腺癌中miR-125b啟動(dòng)子區(qū)CpG島廣泛的甲基化是其下調(diào)的主要原因。在本研究中，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-aza-CR預(yù)處理細(xì)胞后可阻斷PAR2誘導(dǎo)的miR-125b下調(diào)，但是針對(duì)DNA甲基化的MSP檢測(cè)提示:PAR2活化并未引起pri-miR-125b1啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的明顯變化。但是我們發(fā)現(xiàn)，敲降RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Nsun2可以成功阻斷PAR2對(duì)mi

7、R-125b表達(dá)的抑制。進(jìn)一步研究顯示PAR2活化后增加了pre-miR-125b2腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾(N6-methyladenosine，m6A)。此外，敲降Nsun2不僅能阻斷pre-miR-125b2的甲基化及成熟miR-125b表達(dá)的降低，還抑制PAR2介導(dǎo)的Gab2升高。這些結(jié)果提示PAR2下調(diào)miR-125b可能依賴于Nsun2相關(guān)的pre-miR-125b2甲基化修飾。
　　綜上所述，miR-125b