1、目的:
　　砷是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)確認(rèn)的人類致癌物，慢性砷暴露可導(dǎo)致全身多組織器官損傷。砷性癌癥中，皮膚癌與砷暴露的關(guān)系最早被證實(shí)，但機(jī)制尚不明確。存在于皮膚基底層中的表皮干細(xì)胞在無機(jī)砷引發(fā)皮膚癌的過程中，可能是無機(jī)砷攻擊的靶細(xì)胞，最終演變?yōu)榘┌Y干細(xì)胞，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展。干細(xì)胞(Stem cell)是一群能夠自我更新和分化的細(xì)胞，并且作為重要的“儲(chǔ)備力量”進(jìn)行組織修復(fù)。有證據(jù)指出干細(xì)胞對化學(xué)毒物通常具有很強(qiáng)的抗性及耐受力，這既是組

2、織的保護(hù)機(jī)制，也為正常干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y干細(xì)胞的多突變事件積累奠定了基礎(chǔ)。NRF2是重要的抗氧化上游調(diào)節(jié)因子，其介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)體系是正常細(xì)胞抵抗外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激的重要屏障。近來的研究發(fā)現(xiàn)，NRF2還直接參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖與分化，并與腫瘤細(xì)胞的化療、放療耐受性有關(guān)。本研究在以往發(fā)現(xiàn)無機(jī)砷惡性轉(zhuǎn)化皮膚角質(zhì)細(xì)胞中存在癌癥干細(xì)胞蓄積的基礎(chǔ)上，從表皮干細(xì)胞對砷毒性的反應(yīng)性及NRF2在其中的作用入手，嘗試為干細(xì)胞在砷毒性與致癌效應(yīng)中作用的機(jī)

3、制研究提供新線索。
　　研究方法:
　　1.急性砷暴露對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中干細(xì)胞亞群數(shù)量的影響:以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT為研究對象，用50μmol/L亞砷酸鈉(NaAsO2)處理細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+標(biāo)記細(xì)胞，以評(píng)價(jià)干細(xì)胞亞群在急性砷暴露后的變化;
　　2.CD34+人表皮干細(xì)胞的分選與鑒定:用免疫磁珠分選法從HaCaT細(xì)胞中分選CD34+細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞的富集率，并觀察CD3

4、4+細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞（對照細(xì)胞）的全克隆形成能力，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscript Quantitative PCR，RT-qPCR)檢測CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物(CD34、p63、K5、K14、OCT4和SHH)的轉(zhuǎn)錄水平，以判斷分選細(xì)胞的干細(xì)胞特征;
　　3.CD34+細(xì)胞對急性砷毒性的耐受力:將CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞用2.5、5、10、20、40、60、80、100、150(

5、μmol/L) NaAsO2處理24 h，以MTS法檢測細(xì)胞活力。將CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞用20μmol/L、50μmol/L NaAsO2處理24 h，用AnnexinⅤ-FITC與PI雙染法檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量;
　　4.小鼠原代表皮干細(xì)胞的分離與鑒定:收取新生1-3天的小鼠皮膚，用植塊法獲得皮膚成纖維細(xì)胞（對照細(xì)胞），用中性蛋白酶消化法分離真皮層與表皮層，胰酶消化法獲得表皮細(xì)胞懸液，采用差速貼壁法獲得表皮干細(xì)胞，通過免疫熒光法

6、檢測p63和K5表達(dá)以鑒定表皮干細(xì)胞。
　　5.小鼠原代表皮干細(xì)胞對急性砷毒性的耐受力:2.5、5、10、20、40、60、80、100、150(μmol/L) NaAsO2處理24 h后MTS法檢測細(xì)胞活力。
　　6.CD34+細(xì)胞中NRF2表達(dá)與活性:將CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞用10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L NaAsO2處理6h，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測NRF2蛋白表達(dá)水平

7、，RT-qPCR檢測藥物轉(zhuǎn)運(yùn)基因（ABCC1、ABCG2）、解毒酶基因（GST-Pi）、抗氧化基因(HMOX-1、GCLC)的表達(dá)水平;
　　7.CD34+細(xì)胞的砷蓄積和外排情況:CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞用10μmol/L處理24h，用氫化物發(fā)生-原子吸收分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)砷含量;更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h檢測培養(yǎng)液排出的砷含量，用細(xì)胞數(shù)對砷含量進(jìn)行矯正;
　　8.NRF2基因沉默:用攜帶靶向NRF2 shRNA的慢病毒（N

8、RF2-KD）與非靶標(biāo)陰性對照慢病毒（Scramble）轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，用1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞。
　　9.NRF2-KD CD34+細(xì)胞對砷耐受力和自我更新能力:流式細(xì)胞術(shù)分析NRF2-KD沉默對HaCaT細(xì)胞中CD34+細(xì)胞亞群數(shù)量的影響。磁珠分選法得到NRF2-KD和Scramble CD34+細(xì)胞，RT-qPCR確認(rèn)NRF2沉默效率，用10、20、40、60、80、100μmol/L NaAsO2處理N

9、RF2-KD和Scramble CD34+細(xì)胞24 h，以MTS法檢測細(xì)胞活力。低密度接種細(xì)胞觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞全克隆形成能力。
　　結(jié)果:
　　1.急性砷暴露對HaCaT細(xì)胞CD34+亞群生存率的影響:HaCaT細(xì)胞中CD34+細(xì)胞亞群約占0.2-0.7％，50μmol/L NaAsO2處理24 h后，CD34+細(xì)胞亞群增加至9.52％，與對照細(xì)胞比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CD34+的人表皮干細(xì)胞分離

10、與鑒定:經(jīng)免疫磁珠分選后，CD34+細(xì)胞富集率達(dá)78.3±2.5％，顯著高于分選前(P＜0.001);CD34+細(xì)胞全克隆形成數(shù)量為對照組的2.4倍(P＜0.01)，p63、CD34、OCT4、K5、K14和SHH等干細(xì)胞標(biāo)志物在CD34+細(xì)胞中的mRNA水平顯著高于對照細(xì)胞(P＜0.05);
　　3.CD34+細(xì)胞對急性砷毒性的耐受力:在20-80μmol/L NaAsO2濃度范圍內(nèi)， CD34+細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著高于對照組(P

11、＜0.05)，NaAsO2對CD34+細(xì)胞和對照細(xì)胞的半數(shù)致死量(LC50)分別為88.1μmol/L和56.7μmol/L。此外，20μmol/L、50μmol/L NaAsO2急性處理24 h后CD34+細(xì)胞凋亡細(xì)胞低于顯著對照細(xì)胞(P＜0.05):
　　4.小鼠原代表皮干細(xì)胞分離與鑒定:經(jīng)差速貼壁法獲的小鼠原代表皮干細(xì)胞具有表皮干細(xì)胞標(biāo)記物p63和K5表達(dá)，提示細(xì)胞模型建立成功。
　　5.小鼠原代表皮干細(xì)胞對急性砷毒性

12、的高耐受力:2.5、5、10、20、40、60、80、100、150（μmol/L）的NaAsO2處理24 h后，在60-150μmol/L NaAsO2濃度范圍內(nèi)，小鼠原代表皮干細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著高于對照組(P＜0.05)，NaAsO2對小鼠原代表皮干細(xì)胞和對照細(xì)胞的半數(shù)致死量(LC50)分別為102.4μmol/L和80.2μmol/L。
　　6.CD34+表皮干細(xì)胞中NRF2的高表達(dá)與高活性:CD34+表皮干細(xì)胞中NRF2蛋

13、白基礎(chǔ)表達(dá)水平和砷暴露后誘導(dǎo)水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，且藥物轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ABCC1、ABCG2)、解毒酶（GST-Pi）與抗氧化基因（HMOX-1、GCLC）的mRNA水平均顯著高于對照組(P＜0.05);
　　7.CD34+表皮干細(xì)胞具有更強(qiáng)的砷外排能力:24h內(nèi)CD34+細(xì)胞對砷蓄積量顯著低于對照組(P＜0.05)，外排量顯著高于對照組(P＜0.05);
　　8.NRF2基因沉默對表皮干細(xì)胞急性砷毒性耐受力和全

14、克隆形成能力的影響:NRF2-KD細(xì)胞中CD34+細(xì)胞亞群數(shù)無明顯變化;免疫磁珠分選法得到NRF2-KDCD34+細(xì)胞和Scramble CD34+細(xì)胞，RT-qPCR確認(rèn)NRF2沉默效率達(dá)到51.7％(P＜0.05)，在10-100μmol/L NaAsO2濃度范圍內(nèi)，NRF2-KD CD34+組細(xì)胞活力顯著低于Scramble CD34+組(P＜0.05)，LC50分別為69.7μmol/L和56.0μmol/L。NRF2-KDCD