1、目的:利用RT-PCR擴增弓形蟲RH株依鈣蛋白酶相關蛋白(calpain-related)基因的cDNA片段,通過RNA點雜交和Northern blot鑒定該蟲體calpain-related mRNA分子大小;構建原核表達載體并表達重組蛋白,為弓形蟲的疫苗研究提供后選分子。
　　方法:通過感染BALB?c小鼠收集剛地弓形蟲速殖子,提取蟲體總RNA;根據(jù)弓形蟲網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫((http://www.toxodb.org)提供的推測c

2、alpain-related mRNA序列設計PCR擴增引物,用RT-PCR技術擴增弓形蟲calpain-related cDNA片段,所獲得的cDNA片段植入pGEM-T載體,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切法及測序鑒定cDNA序列;再經(jīng)雙酶切將該cDNA片段插入原核表達質(zhì)粒pET32-a,重組表達載體經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ酶切及測序鑒定后,轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)宿主菌,并以IPTG誘導表達calpain-rel

3、ated重組蛋白,用SDS-PAGE鑒定重組蛋白分子量及蛋白表達量。用calpain-related cDNA片段制備核酸雜交探針,用RNA點雜交(Dot-blot)和Northern blot觀察該基因在弓形蟲體內(nèi)表達及calpain-related mRNA分子大小。
　　結果:瓊脂糖凝膠電泳分析表明所提取的弓形蟲總RNA28SrRNA與18SrRNA的比值大于1,條帶清楚。用calpain-related特異引物經(jīng)RT-PC

4、R擴增后獲得弓形蟲RH株calpain-related cDNA片段約500bp,與預期值相符。將該cDNA片段植入pGEM-T載體后經(jīng)雙酶切和測序鑒定,該cDNA片段長500bp, DNA序列與弓形蟲網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫提供的推測calpain-related mRNA序列完全一致。所構建的pET32a?calpain-related表達載體經(jīng)雙酶切和測序鑒定表明表達載體框架和序列正確,該表達載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21宿主菌后在IPTG的

5、誘導下可大量表達重組蛋白,所表達的重組蛋白分子量約26kD,與預期分子量相符。宿主菌所表達的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖親和層析分離柱純化后獲得大量重組蛋白。RNA Dot-blot結果表明calpain-related基因在蟲體內(nèi)表達;Northern blot結果提示弓形蟲calpain-related mRNA的大小約6800bp。
　　結論:本研究成功克隆出弓形蟲calpain-related cDNA片段,并成功構建pE