1、近年來，太湖頻繁爆發(fā)藍藻水華，造成水質(zhì)惡化和湖泊生態(tài)退化，成為影響水資源環(huán)境、制約經(jīng)濟與社會可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素。研究顯示太湖水華優(yōu)勢藻為微囊藻，但關于藍藻、微囊藻、產(chǎn)毒微囊藻在太湖水華中的豐度、分布以及影響因素等生態(tài)特性研究極少，關于太湖產(chǎn)毒微囊藻類的產(chǎn)毒特性和產(chǎn)毒效率的研究尚未見報道。本研究擬建立基于全細胞PCR、RTQ-PCR技術、能對藻類環(huán)境豐度以及產(chǎn)毒能力進行測定與分析的檢測方法；并對太湖水華藻的種類、環(huán)境生態(tài)特征以及太湖

2、產(chǎn)毒微囊藻的產(chǎn)毒特性進行分析；進一步研究太湖土著斑點氣單胞溶藻菌的溶藻作用與機制。預期結果為太湖水華的治理提供有效技術手段和重要基礎數(shù)據(jù)。
　　 一、基于PCR的藍藻、微囊藻、產(chǎn)毒微囊藻及其產(chǎn)毒特性檢測方法的建立
　　 利用針對藻藍蛋白中間基因序列（PC-IGS），微囊藻16s rDNA保守序列（Micr16s rDNA）以及微囊藻毒素合成酶基因B（mcyB）的特異性引物，以FACHH7806標準銅綠微囊藻為陽性藻株，建

3、立檢測藍藻、微囊藻以及微囊藻毒素合成酶基因B的全細胞PCR檢測法，并對全細胞PCR檢測法的靈敏度、特異度進行測定。建立的全細胞PCR快速檢測方法不受藻細胞生長時期的影響，也不受其它藻類細胞或雜菌的干擾。靈敏度測試結果表明，取10μL藻細胞樣品為模板，在30μL反應體系中，PC-IGS的檢測下限為1000cells/反應，mcyB的檢測下限為10000cells/反應；在25μL反應體系中，Micr16s rDNA的檢測下限為10000c

4、ells/反應。
　　 應用SYBR GreenⅠ標記技術，與上述的PCR條件相結合，建立了實時熒光定量檢測藍藻、微囊藻屬、產(chǎn)毒微囊藻在環(huán)境中的相對豐度的RTQ-PCR方法。該方法對藍藻的檢測范圍為106-1011基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9941），微囊藻屬的檢測范圍為104-109基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9936），微囊藻毒素合成酶基因B的檢測范圍為102-105基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9951）。藍藻、微囊藻、微

5、囊藻毒素合成酶基因B初始拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關系曲線表達式分別為：Ct=-3.1466Lg Copy number+45.816，Ct=-3.0369Lg Copy number+42.551，Ct=-3.3120 Lg Copy number+31.297。
　　 應用本實驗室研究的SPE-HPLC提取、分析微囊藻毒素的技術，繪制MC-LR標準曲線，并對方法靈敏度、回收率和精密度進行測定，提出以單位藻細胞產(chǎn)MC-LR的量反

6、映藻細胞的產(chǎn)毒能力的概念。結果顯示，建立的HPLC檢測法對MC-LR檢測的濃度范圍為0.1-10.0μg/mL，標準曲線為y=38.797x+17.536（r=0.9990），平均回收率為92.1％，變異系數(shù)為5.8％。
　　 二、太湖水華優(yōu)勢藻環(huán)境特性的研究
　　 利用全細胞PCR檢測法對自太湖梅梁灣分離獲得的兩株藻株TH1、TH2進行鑒定，并結合HPLC、RTQ-PCR對產(chǎn)毒株TH1的產(chǎn)毒特性進行研究。結果顯示，自太

7、湖梅梁灣分離獲得的TH1藻株為產(chǎn)毒微囊藻，TH2為不產(chǎn)毒微囊藻。培養(yǎng)15天的太湖產(chǎn)毒藻株TH1胞外藻毒素產(chǎn)量為0.085±0.017μg/108cells，總藻毒素產(chǎn)量為0.594±0.023μg/108cells。太湖產(chǎn)毒藻株TH1微囊藻毒素合成酶基因B的表達能力為FACHH7806標準銅綠微囊藻的1/16.826。
　　 對太湖南泉水域進行了為期一年的水質(zhì)、藻類環(huán)境豐度和產(chǎn)毒能力的監(jiān)測與評價。結果表明，南泉水域的水污染程度與

8、富營養(yǎng)化程度均為中度：5～11月總藻密度均超過水華閾值（106cells/L），9月份達到109cells/L_的最高值；微囊藻是太湖南泉地區(qū)的優(yōu)勢藻，其環(huán)境豐度維持在80～90％左右；產(chǎn)毒微囊藻的環(huán)境豐度在5～10月均高于40％，隨著水溫的下降，其環(huán)境豐度迅速降低并在12月降到了5.66％；總藻產(chǎn)MC-LR的能力在6、11月份，分別出現(xiàn)兩個峰值；產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)MC-LR的能力為1.661～9.293μg/億細胞。11～12月隨著水溫和藻

9、密度的急速下降，產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)MC-LR的能力顯著增強。結果提示太湖南泉水域全年大部分時間存在水華，微囊藻為其優(yōu)勢藻，產(chǎn)毒微囊藻的環(huán)境豐度及其產(chǎn)MC-LR能力的動態(tài)變化與水溫密切相關。冬季產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)毒能力顯著增強。因此，在水華和非水華期內(nèi)，對有害藻華的防制都應予以重視。
　　 三、斑點氣單胞溶藻菌除藻作用與溶藻活性物質(zhì)的研究
　　 斑點氣單胞菌對濃度為106cells/mL，的標準藻、太湖野生微囊藻TH1和TH2的48h

10、溶藻率分別為65.82％、78.04％和82.67％。其溶藻活性隨溶藻菌濃度升高而增強，104-107cells/mL的斑點氣單胞菌48h溶藻率分別為16.25％、18.75％、48.75％、81.25％。其溶藻活性強弱與藻細胞初始濃度呈現(xiàn)負相關，對103-106個/mL藻細胞48h溶藻率分別為100％、100％、90.24％、80.46％。處于不同生長周期的斑點氣單胞溶藻菌對藻細胞的溶解能力差異較大，對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期、衰退期的斑

11、點氣單胞溶藻菌對106/mL，藻細胞48h溶藻率分別為30.54％、53.75％、72.50％。其對處于不同生長周期的銅綠微囊藻溶藻能力略有不同，對濃度為106/mL，處于對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期的銅綠微囊藻48h溶藻率分別為47.34％、53.41％、74.68％。溫度對其溶藻影響較大，隨著溫度的升高，溶藻能力升高，15℃、25℃、35℃組對106/mL藻細胞48h溶藻率依次為25.35％、56.71％、72.73％。斑點氣單胞溶藻菌主

12、要通過分泌胞外活性成分來溶解藻細胞。在30-120℃范圍內(nèi)，溫度升高有助于提高胞外活性成分的除藻能力。在pH5-9的范圍內(nèi)，偏堿性條件有助于提高胞外活性成分的除藻能力。石油醚、氯仿、乙酸乙酯等不同極性有機溶劑萃取實驗結果表明，隨著有機溶劑極性的升高，溶劑有機相萃取到的活性成分就越多。<2kDa活性組分48h溶藻作用是胞外濾液溶藻作用的87.27％。抗氧化測試發(fā)現(xiàn)胞外濾液在常溫下放置4天后，溶藻活性降低了55％，而添加了1％的抗壞血酸（V

13、c）的胞外濾液溶藻率僅僅只下降了4％。乙醇沉淀實驗顯示乙醇提取液48小時的溶藻作用是胞外濾液溶藻作用的92.17％，而醇析沉淀物幾乎沒有溶藻作用。斑點氣單胞菌胞外濾液中未檢測到含有多糖、蛋白質(zhì)、核酸、抗生素雖有檢測到，但乙醇沉淀實驗否定了活性物質(zhì)為核酸的可能。
　　 溶藻活性物質(zhì)經(jīng)5倍體積的無水乙醇4℃冰箱中過夜抽提，抽提液經(jīng)離心（4000r/min，10min）后旋轉蒸發(fā)待無水乙醇完全蒸發(fā)，經(jīng)硅膠（100～200目）柱分離，以

14、氯仿/甲醇=2:1、1:1、0:1進行梯度洗脫，得到兩個主要溶藻組分。紫外（365nm）燈下可見兩組分均呈現(xiàn)藍紫色熒光，組分1呈淡黃色，不定型顆粒狀，組分2呈棕黃色，油狀。兩組分均有一定的溶藻能力，但組分2的溶藻能力要強于組分1，推斷斑點氣單胞菌分泌的溶藻活性物質(zhì)為多組分抑藻物質(zhì)。官能團顯色實驗和紫外掃描結果提示斑點氣單胞菌分泌的溶藻活性物質(zhì)可能是含有苯環(huán)結構的胺類還原性物質(zhì)。LC/MS-IT-TOF分析結果顯示斑點氣單胞菌分泌的溶藻活