1、改善急性心肌梗死后心室重塑是提高患者生存率及生活質(zhì)量的關(guān)鍵。心室重塑的過程涉及各種因素，包括心肌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的代謝失衡。ECM是一個動態(tài)的微環(huán)境，主要是由膠原蛋白組成，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。當(dāng)心肌成纖維細(xì)胞受到各種信號因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）等因子的刺激，就會引起膠原的分泌，使膠原過多沉積，引起心肌纖維化。TGF-β1是TG

2、F-β家族中所占比例最高、活性最強(qiáng)的亞型，它在膠原代謝的生理和病理過程中起著極其重要的作用，而 Smads作為一種信號通路蛋白，能轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β家族信號從細(xì)胞膜受體到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)，形成TGF-β/Smads是激活心肌纖維化過程中的重要信號通路。
　　微小RNA家族是近年來研究的熱點(diǎn)，它參與并正向或負(fù)向調(diào)控眾多基因的表達(dá)、翻譯過程，在細(xì)胞分化、凋亡、腫瘤及生長發(fā)育等過程發(fā)揮重要作用。研究者們也發(fā)現(xiàn)miRNA在纖維化疾病中的作用，特別是

3、miR-29可能通過一些機(jī)制參與了心肌梗死后心肌纖維化的過程。
　　丹參酮IIA（Tanshinone IIA，TSN）是中藥丹參的主要脂溶性活性成分，其具有明確的分子結(jié)構(gòu)。大量的臨床研究證明，TSN在抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等方面具有多種功效。目前已有研究報道它具有抗纖維化作用。TSN在臨床上被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，它能否抗心肌纖維化及對心梗后心室重塑的影響值得我們?nèi)パ芯俊?br>　　本研究擬分為三部分，

4、從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床觀察，來探討miRNA-29b介導(dǎo)TSN在心肌梗死后心室重塑的抗纖維化作用及其與TGF-β/Smad信號通路的關(guān)系。更進(jìn)一步探討TSN對心肌梗死患者心室重塑的干預(yù)效果，從而為該藥在抗心梗后心室重塑的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：TSN通過上調(diào)miR-29b的表達(dá)改善心肌梗死后心室重塑和心功能的研究
　　目的:
　　觀察TSN對心肌梗死后大鼠心臟形態(tài)及功能的作用，探討miR-29b介導(dǎo)的TS

5、N在心肌梗死后心室重塑的抗纖維化作用靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1．通過結(jié)扎冠狀動脈前降支建立大鼠的心肌梗死模型。將實(shí)驗(yàn)動物分為5組：心肌梗死模型小組（AMI）（n=15，予以同等量生理鹽水，灌胃，每天）；丹參酮IIA低劑量組（TSN-L）（n=15，給藥劑量為5mg/kg/day溶于生理鹽水，灌胃，每天）；丹參酮IIA中劑量組（TSN-M）（n=15，給藥劑量為10mg/kg/day溶于生理鹽水，灌胃，每天）；丹參酮IIA高劑

6、量組（TSN-H）（n=15，給藥劑量為15mg/kg/day溶于生理鹽水，灌胃，每天）；假手術(shù)組（sham）（n=15，予以同等量生理鹽水，灌胃，每天）。心肌梗死模型構(gòu)建成功后第二天開始灌胃給藥，灌胃給藥治療共計4周。再給予大鼠麻醉后用小動物超聲儀檢查其心臟大小及心功能指標(biāo)。
　　2．采集心臟心肌梗死部分組織，制作病理切片。Masson染色觀察心肌纖維化的程度；用實(shí)時定量 PCR檢測心臟組織 TGF-β1、Col1a1、Col3

7、a1mRNA以及miR-29b的表達(dá)水平；Western blot方法檢測組織蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1．心臟超聲結(jié)果顯示：AMI組大鼠的LVAWd和LVAWs值比假手術(shù)組顯著降低，TSN+AMI治療組的LVAWd和LVAWs值比AMI組顯著增高。LVIDd和LVIDs值在AMI組與假手術(shù)組相比顯著增高，反之，經(jīng)TSN干預(yù)組LVIDd和LVIDs值較AMI組顯著降低。左室EF值（％）和FS值（%）也在AMI組比較假手術(shù)

8、組顯著降低（P<0.01）。TSN-H+AMI治療能有效改善AMI導(dǎo)致的EF（%）和FS（%）降低。
　　2．Masson染色結(jié)果提示，心肌梗死區(qū)的CVF在TSN-H+AMI和TSN-M+AMI治療組比較AMI組是顯著降低。
　　3．定量RT-PCR分析表明，TGF-β1，Col1a1和Col3a1的mRNA表達(dá)水平在TSN-M+AMI和TSN-H+AMI組的梗死區(qū)中顯著下降。Western blot檢測結(jié)果進(jìn)一步表明，TG

9、F-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)也在 TSN-M+AMI和 TSN-H+AMI組的梗死區(qū)顯著降低。相比之下，TSN-M+AMI和 TSN-H+AMI組在梗死區(qū)的miR-29b的表達(dá)顯著高于AMI組。
　　結(jié)論:
　　1．TSN改善AMI大鼠的心臟大小結(jié)構(gòu)及左心室功能。
　　2．TSN減少心肌梗死組織的膠原纖維分布，達(dá)到抗心肌纖維化的作用。
　　3．在心肌梗死后心室重塑的過程中TSN顯著抑制TGF-β1和心肌成纖維細(xì)

10、胞分化中的表達(dá)，但增加了miR-29b的表達(dá)。還表明TGF-β1的上調(diào)和miR-29b的下調(diào)之間呈負(fù)相關(guān)。
　　4．TSN通過上調(diào)miR-29b的表達(dá)水平，進(jìn)一步阻斷TGF-β1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制心肌纖維化，改善梗死后心室重塑。
　　第二部分：TSN通過上調(diào)miR-29b表達(dá)介導(dǎo)TGF-β/Smads信號通路調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞功能的研究
　　目的:
　　探討 TSN對心肌成纖維細(xì)胞處理后由 miR-29b表達(dá)介導(dǎo)

11、的 TGF-β1/Smads信號通路的作用機(jī)制，進(jìn)一步從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中明確TSN的抗纖維化作用。
　　方法:
　　取出生1-3天的SD大鼠乳鼠10只，取出左室心肌組織，分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞。用TGF-β1或/和不同濃度的TSN處理心肌成纖維細(xì)胞，檢測miR-29b以及纖維化指標(biāo)的改變，選擇最適濃度的TSN用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b抑制劑及Smad3 siRNA。用實(shí)時定量PCR檢測處理后的心肌成纖維細(xì)胞

12、TGF-β1、Col1a1、Col3a1mRNA以及 miR-29b的表達(dá)水平，Western blot方法檢測處理后心肌成纖維細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)及進(jìn)一步Sircol Collagen Assay檢測處理后心肌成纖維細(xì)胞膠原含量的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1．經(jīng)TGF-β1和TSN處理的心肌成纖維細(xì)胞中測量miR-29b的表達(dá)和膠原蛋白含量。用10μM和50μM的TSN治療后其抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的上調(diào)Col1a1和Col3

13、a1在mRNA水平的表達(dá)，也抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞中P-Smad3和α-SMA的蛋白水平表達(dá)。膠原含量測定的結(jié)果表明，經(jīng)10μM和50μM的 TSN處理后心肌成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白的表達(dá)明顯被抑制。與對照組比較，經(jīng)TSN10μM和50μM處理后心肌成纖維細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2．在定量RT-PCR結(jié)果表明了miR-29b抑制劑抑制了TSN誘導(dǎo)的Col1a1和Col3a1 mRNA水平下調(diào)。膠

14、原含量測定結(jié)果表明，miR-29b抑制劑治療能顯著逆轉(zhuǎn)TSN誘導(dǎo)的膠原水平的降低。Western blot結(jié)果也顯示miR-29b抑制劑能夠消除TSN誘導(dǎo)的α-SMA的表達(dá)下調(diào)，而對p-Smad3及Smad3蛋白表達(dá)均無明顯影響。
　　3．將轉(zhuǎn)染 Smad3 siRNA的心肌成纖維細(xì)胞，通過定量RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Col1a1和Col3a1的mRNA水平顯著下降，而miR-29b的表達(dá)水平增加。Western blot結(jié)果顯示，

15、TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA的上調(diào)可以通過Smad3蛋白的siRNA被顯著抑制。此外，經(jīng)Smad3 siRNA處理的心肌成纖維細(xì)胞在膠原蛋白含量也表現(xiàn)出顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1．在心肌成纖維細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中，TSN能抑制TGF-β的信號傳導(dǎo)途徑，同時能上調(diào)miR-29b的表達(dá)，這表明的miR-29b可能參與了TGF-β介導(dǎo)的心肌纖維化的表達(dá)。
　　2．miR-29b抑制劑的應(yīng)用又反過來拮抗了TSN的抗纖維化作用。<

16、br>　　3．在心肌成纖維細(xì)胞中miR-29b參與了TGF-β/Smad3信號通路下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)， miR-29b的表達(dá)被Smad3蛋白調(diào)節(jié)，介導(dǎo)了TSN抗心梗后心肌纖維化的作用。
　　第三部分：TSN對AMI患者心室重塑的影響及臨床觀察
　　目的:
　　觀察TSN治療AMI患者心臟大小及心功能和血漿miR-29b、TGF-β1指標(biāo)的水平變化以明確TSN的抗心梗后心室重塑的作用。
　　方法:
　　1．結(jié)合入選排

17、除標(biāo)準(zhǔn)選擇68例急性前壁ST段抬高心肌梗死患者，所有患者均在發(fā)病12h內(nèi)行急診PCI，造影顯示前降支病變并血管開通后TIMI3級，后藥物觀察。隨機(jī)分成兩組：TSN組35例，常規(guī)組33例。TSN組為常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用TSN注射液60-80mg配至液體靜脈滴注，每日一次，共14天。
　　2．分別采集入院1天及14天后患者清晨空腹靜脈血，離心后保存待用。用酶聯(lián)免疫分析法檢測血漿TGF-β1水平。提取血漿總RNAs，利用逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時定量P

18、CR反應(yīng)檢測血漿miR-29b水平。
　　3．所有患者心肌梗死1天，14天，60天時分別行心臟超聲檢查，測量心臟左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），連續(xù)測量3個心動周期取平均值。
　　結(jié)果:
　　1．兩組患者年齡、性別、合并高血壓、糖尿病、吸煙、血脂，開通血管時間及常規(guī)藥物使用情況比較均無顯著性差異。
　　2．兩組患者在心肌梗死1天時LVIDd、LVIDs、E

19、F（%）指標(biāo)無顯著性差異。常規(guī)組和TSN組治療14天、60天時LVIDd、LVIDs、EF（%）指標(biāo)均有所改善，其中TSN組指標(biāo)比較1天時LVIDd、LVIDs明顯減小，EF（%）明顯增強(qiáng)，有顯著性差異。
　　3．結(jié)果顯示，與常規(guī)治療組比較，TSN治療前TGF-β1水平無顯著性差異；14天后，兩組患者血漿 TGF-β1水平明顯降低，且加用 TSN治療組較常規(guī)組TGF-β1水平下降有顯著性差異。
　　4．結(jié)果顯示，與常規(guī)治療組

20、比較，TSN治療前miR-29b水平無顯著性差異；14天后，兩組患者血漿 miR-29b水平明顯降低，且加用 TSN治療組較常規(guī)組miR-29b水平下降有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1．在臨床AMI患者中，合用TSN治療能改善心肌梗死后心臟大小結(jié)構(gòu)及心功能。
　　2．檢測患者血漿TGF-β1水平，TSN治療能降低TGF-β1表達(dá)水平，減弱了TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化過程。
　　3．TSN能上調(diào)miR-29b表