1、目的：
　　紫杉醇是從紅豆杉中提取的抗腫瘤藥物，水溶性較差。紫杉肽是紫杉醇的聚合衍生物，是在紫杉醇C13側(cè)鏈的2'位上通過酯鍵與多肽聚合而成，分子量在10～40 kDa范圍內(nèi)。紫杉肽表現(xiàn)出良好的水溶性和抗腫瘤活性。紫杉肽中紫杉醇含量分析方法的建立對紫杉肽研發(fā)具有重要意義，雖然可以通過紫杉肽制備過程中的投料量確定紫杉醇理論含量，但是，紫杉肽的分子量不均一且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以對其中紫杉醇的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，未見國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道利用色譜法測定紫

2、杉肽中紫杉醇含量。本研究旨在建立紫杉肽中紫杉醇含量的體內(nèi)、外分析方法，為紫杉肽的藥學(xué)資料研究、毒理學(xué)、藥理學(xué)研究和臨床研究中的含量分析提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　在紫杉肽中包括與多肽鏈結(jié)合的結(jié)合型紫杉醇和未與多肽鏈結(jié)合的游離型紫杉醇。首先，建立游離紫杉醇的含量分析方法，紫杉肽經(jīng)液-液萃取法萃取其中游離紫杉醇后，通過HPLC法檢測分析;分別通過不同種類蛋白酶和不同pH溶液水解連接紫杉醇和多肽鏈的酯鍵，以液-液萃取法萃取其中

3、紫杉醇后，HPLC法檢測分析，通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較，初步確定水解反應(yīng)的效率;通過對紫杉肽在不同溶液中水解規(guī)律的研究，發(fā)現(xiàn)紫杉肽及紫杉醇在pH＞13.0溶液中極不穩(wěn)定，將反應(yīng)后溶液分離、純化后，得到紫杉醇的單一水解產(chǎn)物，通過對紫杉醇穩(wěn)定且特有的水解產(chǎn)物的鑒定和檢測分析，間接對紫杉肽中紫杉醇含量進(jìn)行測定。
　　結(jié)果：
　　1.紫杉肽中游離紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證。
　　紫杉肽中游離紫杉醇以乙醚萃取后，參考《中

4、華人民共和國藥典》二部（2010版）紫杉醇注射制劑含量分析方法，建立了紫杉醇HPLC分析方法，采用Thermo Hypersil GOLD(4.6×150 mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶水(50∶50，v/v)，檢測波長為227 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，簡單、易操作，適用于紫杉醇的含量分析研究。測得5個(gè)批次紫杉肽中，每瓶含游離紫杉醇的量在21.6～79.2μg范圍內(nèi)。
　　2.紫杉肽中結(jié)合型紫杉

5、醇解離實(shí)驗(yàn)。
　　紫杉肽分別經(jīng)枯草桿菌蛋白酶、嗜熱桿菌蛋白酶和pH1.9～13.0溶液水解處理后，以乙醚萃取其中紫杉醇并檢測分析，通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較，計(jì)算水解比率。結(jié)果表明，不同溶液中紫杉肽的水解比率各不相同:紫杉肽經(jīng)嗜熱桿菌蛋白酶處理后，測得酶解率為10.57％，紫杉肽經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后，測得酶解率為12.49％;紫杉肽經(jīng)pH9.2溶液處理后，測得紫杉醇量最高，約占紫杉醇理論含量的23.29％。兩種方法測得結(jié)果

6、均與紫杉肽中紫杉醇理論含量相差較多，可能原因有紫杉醇在處理?xiàng)l件下不穩(wěn)定和處理過程不徹底。因此，以上兩種方法未能將紫杉肽中的紫杉醇穩(wěn)定可控的解離，從而實(shí)現(xiàn)紫杉肽中紫杉醇含量分析的目的。當(dāng)以pH為13.0溶液溶解紫杉肽后，未檢測到紫杉醇，說明紫杉醇在該條件下極不穩(wěn)定。
　　3.紫杉肽和紫杉醇?jí)A性條件下水解產(chǎn)物分析。
　　通過紫杉肽在不同溶液中水解過稱研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇和紫杉肽在pH＞13.0條件下易水解，生成一系列化合物，通過液相

7、色譜方法對紫杉醇的系列水解產(chǎn)物分離純化，制備了約5.7 mg單一水解產(chǎn)物。通過質(zhì)譜和1HNMR初步推斷其結(jié)構(gòu)，在購得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品后，通過UPLC、UV和MRM等方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證，最終確定該水解產(chǎn)物為紫杉醇母核13'位上側(cè)鏈的羧酸鈉。分子式為:C16H14NNaO4;分子量為:307.08。
　　4.紫杉肽中紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證。
　　紫杉肽和紫杉醇經(jīng)0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解后，以Agilent1290

8、UPLC檢測分析，采用Waters BEH C18(2.1×50 mm，1.7μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶水(10∶90，v/v)，檢測波長為227 nm。紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)水解后，與相同物質(zhì)的量濃度的紫杉醇C13側(cè)鏈標(biāo)準(zhǔn)品比較，結(jié)果測得峰面積之比與理論值的偏差為-0.70％，說明紫杉醇的水解反應(yīng)是徹底的;分析方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，滿足藥典規(guī)定藥物含量測定方法學(xué)要求。測得5個(gè)批次紫杉肽中，每瓶中紫杉醇含量在31.80～37.38mg范圍內(nèi)。<

9、br>　　5.血漿樣品中紫杉肽分析方法的建立及方法學(xué)確證。
　　紫杉肽樣品和紫杉醇溶液與人血漿混合后，用0.2 mol.L-1氫氧化鈉水解處理，再以兩倍體積乙腈除去樣品中的蛋白質(zhì)后，通過UPLC-MS/MS法檢測分析。通過對紫杉醇與紫杉肽共有的水解產(chǎn)物的測定，實(shí)現(xiàn)了對血漿樣品中紫杉肽的紫杉醇含量準(zhǔn)確測定的目的。結(jié)果表明，該方法水解反應(yīng)穩(wěn)定徹底，靈敏度高，專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，測得5個(gè)批次紫杉肽中，每瓶中紫杉醇含量在31.85