1、蘑菇和靈芝等作為食物和藥物在中國應用已久，中國傳統(tǒng)醫(yī)學將其應用于疾病的預防和治療。目前研究發(fā)現(xiàn)從不同機體如細菌、真菌、植物和其他的有機體提取的多糖具有良好的免疫調節(jié)效應，它能夠與宿主細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞表面的選擇性受體（如dectin-1）相互作用，從而激活巨噬細胞和樹突狀細胞的功能產(chǎn)生相應的免疫應答。在香菇和靈芝等的提取物中發(fā)現(xiàn)了很多活性物質，具有廣泛生物學功能，香菇多糖就是其中一種重要的生物活性物質，具有免疫調節(jié)活性和抗腫瘤活

2、性，能夠調節(jié)巨噬細胞和樹突狀細胞的功能。香菇多糖通過上調巨噬細胞和樹突狀細胞MHC分子和協(xié)同刺激分子的表達，增強巨噬細胞和樹突狀細胞的成熟和活化從而發(fā)揮抗原遞呈功能，同時也能夠促進巨噬細胞和DC分泌細胞因子，發(fā)揮免疫調節(jié)作用和抗腫瘤作用。多糖和寡糖在抗炎癥反應和抗自身免疫性疾病方面也有很多的報道，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎作用，抑制炎癥因子表達，促進抗炎因子表達等作用，并且能夠保護機體免受免疫反應造成的損傷。鑒于多糖和寡糖的廣泛生物學功能和免

3、疫調節(jié)作用，其在藥物設計和疫苗研究方面多有應用。
　　目前報道發(fā)現(xiàn)香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤活性與其結構和分子量相關，香菇多糖主鏈形成三螺旋構象對于其發(fā)揮生物學功能具有重要的作用，以β-(1→6)連接為主鏈，β-(1→3)連接為側鏈的β寡糖是香菇多糖的一個基本結構單位，被認為是香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的重要結構，實驗中發(fā)現(xiàn)人工合成的以β-(1→6)連接為側鏈，β-(1→3)連接為主鏈的β寡糖及其主鏈含有α-(1→3)連接的β寡糖類似物具有和

4、天然提取的香菇多糖相似的抗腫瘤作用，能夠促進脾細胞的增殖和腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌。由于目前應用的大部分多糖都是植物或動物以及其他物種的提取物，存在結構不確定性，純度不高以及產(chǎn)量較少的問題，而實驗發(fā)現(xiàn)合成的多糖基本結構單位和多糖具有相似的生物學效應，而且人工合成的寡糖具有結構明確，純度高和產(chǎn)量高等優(yōu)點，因此人們基于這些多糖的基本結構單位人工合成寡糖并觀察其生物學功能。
　　在本實驗中，顧建新教授課題組基于香菇多糖和其他β多

5、糖的基本結構，人工合成了主鏈包含有一個α-(1→3)連接的，以β-(1→6)連接為側鏈，β-(1→3)連接為主鏈的六聚體β寡糖，我們研究了人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞成熟活化及其細胞因子表達的調節(jié);以HT29細胞，人外周血單個核細胞和單核細胞為模型，初步探討了人工合成β寡糖對人源免疫細胞功能調節(jié)的機制;并觀察了人工合成β寡糖對樹突狀細胞成熟活化及其細胞因子表達的調節(jié)。
　　一.人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞成熟活化及其細胞因

6、子表達的調節(jié)
　　1.人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞表面分子和炎癥相關細胞因子表達的影響
　　人工合成β寡糖處理小鼠腹腔巨噬細胞，F(xiàn)ACS檢測發(fā)現(xiàn)細胞表面受體CD40表達上調，而CD86及MHC(Ⅰ)，(Ⅱ)分子沒有明顯變化。CD40是重要的協(xié)同刺激分子，在激活T細胞的免疫應答方面起著重要的作用，提示β寡糖有利于巨噬細胞發(fā)揮其抗原呈遞功能。
　　用Real-Time PCR檢測寡糖處理細胞后炎癥相關細胞因子的轉錄水平

7、，發(fā)現(xiàn)IL-12，IL-6的表達有不同程度的上調（未處理組的2.5-2.7倍），而IL-10表達下調（未處理組的1/5）。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)，TNF-α，IL-6和IL-12分泌增加，IL-10分泌減少。TNF-α是抗感染和炎癥反應中巨噬細胞的一個重要調節(jié)因子，而且在抗腫瘤方面具有重要的作用。IL-12是重要的T細胞活化因子，能夠刺激T細胞和NK細胞生成IFN-γ和TNF-α，并且減少IL-4介導的IFN-γ的抑制。IL-1

8、0是重要的抗炎因子，在調節(jié)巨噬細胞的功能方面起著重要作用，主要由Th2類免疫細胞分泌，它能夠抑制巨噬細胞的功能。這些結果提示人工合成β寡糖能夠通過調節(jié)炎癥因子和抑炎因子的分泌調節(jié)巨噬細胞的功能。
　　為了進一步研究人工合成β寡糖對小鼠巨噬細胞分泌免疫調節(jié)相關細胞因子的影響，我們用Mouse Cytokine Array Panel A檢測了調節(jié)細胞間相互作用的趨化因子及細胞因子等細胞外信號分子。結果顯示，β寡糖對CCL1，CCL2

9、，CCL3，CCL4, CCL5, CCL12, CXCL10, TIMP-1, G-CSF, KC, CD54, MIP-2, IL-1α,IL-1β，IL-6，IL-16，IL-17，IL-23，IL-1ra，IFN-γ和TNF-α的分泌有明顯的促進作用。
　　為探討人工合成β寡糖在發(fā)揮免疫調節(jié)功能時的作用機制，我們用β寡糖處理小鼠腹腔巨噬細胞，定量PCR芯片技術檢測與炎癥及自身免疫相關細胞因子，發(fā)現(xiàn)β寡糖處理前后部分趨化因子

10、及其受體、部分白介素家族成員及其受體等基因表達有差異，其中有38個細胞因子的變化具有統(tǒng)計學意義（上調18個，下調20個）。進一步分析與這些細胞因子表達相關的轉錄因子，找到39個轉錄調節(jié)因子，其中7個是MAPK信號通路上的重要因子，與MAPK信號通路的活化有密切關系。同時，分析這7個轉錄因子所對應的與炎癥及自身免疫相關細胞因子，我們發(fā)現(xiàn)了以下幾個重要的細胞因子:Tnfsf14，其主要作用是促進T細胞增殖，觸發(fā)腫瘤細胞凋亡;Nos2，誘導型

11、一氧化氮合酶，在抗微生物和抗腫瘤反應中發(fā)揮重要的生物學作用;CCR6，在炎癥反應時調節(jié)樹突狀細胞和T細胞的遷移與募集。
　　2.人工合成β寡糖發(fā)揮免疫調節(jié)作用相關細胞信號轉導通路的研究
　　Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，人工合成β寡糖能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞MAPK通路上關鍵蛋白ERK的磷酸化水平，對其上游活化因子c-Raf的磷酸化也有上調作用。當巨噬細胞ERK磷酸化被抑制時，β寡糖對巨噬細胞細胞因子轉錄的調節(jié)也消失;當

12、β寡糖促進巨噬細胞ERK磷酸化的作用恢復后，可以觀察到其對細胞因子轉錄的調節(jié)。通過檢測PI3K/AKT通路上關鍵蛋白的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)人工合成β寡糖抑制了AKT蛋白Thr308位點和Ser473位點的磷酸化。同時，寡糖上調AKT信號通路上游抑制因子PTEN磷酸化和受AKT磷酸化負調控的GSK-3β的磷酸化，并且下調AKT信號通路上游活化因子PDK-1的磷酸化。
　　3.人工合成β寡糖發(fā)揮免疫調節(jié)作用相關受體和信號通路的研究

13、　　分別用TLR-2，TLR-4和Dectin-1的抗體預處理小鼠腹腔巨噬細胞，然后用人工合成β寡糖處理細胞，Western Blot分別檢測MAPK和PI3K/AKT信號通路上關鍵蛋白磷酸化水平，實驗發(fā)現(xiàn)寡糖對ERK磷酸化上調作用與TLR-2和Dectin-1受體相關，而對AKT蛋白磷酸化的抑制只與Dectin-1受體相關。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌，發(fā)現(xiàn)當TLR2被阻斷后，用β寡糖處理的細胞上清中TNF-α和IL-6

14、分泌量比未處理組的量明顯減少，IL-10的分泌量明顯增加。TLR-4被阻斷后，用寡糖處理的細胞上清中TNF-α，IL-12和IL-10的分泌量與未處理組相比沒有明顯變化，IL-6分泌量則明顯減少。當Dectin-1受體被阻斷后，用β寡糖處理的細胞的上清中TNF-α和IL-12分泌量比未處理組的量明顯減少。結果提示實驗中使用的人工合成β寡糖對巨噬細胞分泌細胞因子的影響有可能和TLR2，TLR4和Dectin-1受體有關。
　　二.人

15、工合成β寡糖對人單核細胞細胞因子表達調節(jié)及其信號轉導通路的影響
　　IL-18是IL1細胞因子超家族中的一員，是IFN-γ產(chǎn)生的主要誘導因子之一，在調節(jié)機體免疫反應中起著重要作用，能夠調節(jié)天然免疫應答和獲得性免疫應答，而且也是一個能夠在不同的免疫環(huán)境中調節(jié)Th1或Th2類免疫應答的細胞因子。除了這些作用以外，IL18也參與到慢性炎癥反應和自身免疫性疾病當中。
　　β寡糖分別處理HT29細胞和人單核細胞，通過Real-time

16、 PCR檢測IL-18、IL-18BP、TIR8等細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)在HT29細胞和人單核細胞中，β寡糖能夠能夠增強IL-18BP的表達，并提高IL-18BP/IL-18的比例。文獻報道過量表達TIR8能夠抑制IL-18作用，我們的研究中卻發(fā)現(xiàn)β寡糖對人單核細胞表達TIR8起抑制作用。
　　為進一步證實人工合成β寡糖對人PBMC/PBM細胞間相互作用的趨化因子及細胞因子等細胞外信號分子的調節(jié)作用，我們用Human Cytokin

17、e Array Panel A檢測了細胞培養(yǎng)上清中趨化因子及細胞因子的分泌情況。結果顯示在PBMC中，寡糖能夠促進CCL5，CXCL1，MCP-1，MIF，MIP-lalpha和IL-6的分泌。在單核細胞中，經(jīng)β寡糖處理后，趨化因子CCL5，CXCL1，MCP-1，MIF，MIP-1α，IL-8分泌增加;細胞因子IL-6，TNF-α和IL-1ra分泌增加。
　　為進一步研究人工合成β寡糖在發(fā)揮免疫調節(jié)功能時的作用機制，我們用β寡糖

18、處理健康人外周血單個核細胞(PBMC)，定量PCR芯片技術檢測與炎癥及自身免疫相關細胞因子，發(fā)現(xiàn)β寡糖處理前后部分趨化因子及其受體、部分白介素家族成員及其受體等基因表達有差異，其中有22個細胞因子的變化具有統(tǒng)計學意義（上調17個，下調5個）。進一步分析與這些細胞因子表達相關的轉錄因子，找到38個轉錄調節(jié)因子，其中7個是MAPK信號通路上的重要因子，與MAPK信號通路有密切關系。同時，分析這7個轉錄因子所對應與炎癥及自身免疫相關細胞因子，

19、我們發(fā)現(xiàn)了以下幾個重要的細胞因子:NFATC3(Nuclear factor of activatedT-cells，cytoplasmic3)，其主要作用是調節(jié)T細胞基因表達;SYK（脾酪氨酸激酶）潛在的腫瘤抑制因子;SCYE1，細胞凋亡時表達，能促進腫瘤壞死因子發(fā)揮作用。β寡糖對于這幾個細胞因子的表達都具有促進作用。在人工合成β寡糖對人PBMC活化相關信號通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)β寡糖作用早期（2-4小時），細胞中ERK的磷酸化增強。

20、同時，人工合成β寡糖能夠促進人單核細胞ERK磷酸化，并且抑制PI3K/AKT通路上AKT蛋白的磷酸化。
　　三.人工合成β寡糖對樹突狀細胞成熟活化及其細胞因子表達的調節(jié)
　　鑒于樹突狀細胞在天然免疫應答和獲得性免疫應答中的重要作用，本實驗觀察以骨髓來源的DC作為細胞模型觀察β寡糖的免疫調節(jié)作用。實驗根據(jù)文獻報道分離骨髓細胞，并在細胞因子IL-4和GM-CSF作用下分化為樹突狀細胞(MDC)，通過體外細胞模型觀察人工合成β寡糖

21、對DC細胞功能的影響。β寡糖100μg/ml處理小鼠骨髓來源樹突狀細胞24小時，細胞表面的CD40表達指數(shù)為136.1（未處理組為123.4）;CD86表達指數(shù)為30.1（未處理組為20.6）;MHCⅠ表達指數(shù)為110.1（未處理組為60.6），MHCⅡ表達指數(shù)為8.1（未處理組為3.42）。人工合成β寡糖100μg/ml處理小鼠骨髓來源樹突狀細胞4小時，與未加β寡糖組相比，DC細胞TNF-α和IL-12轉錄水平提高，IL-10轉錄水平

22、降低;β寡糖處理DC細胞48小時，與未加β寡糖組相比，細胞上清中TNF-α和IL-6分泌量增加，IL-10分泌量減少，提示β寡糖能夠增強骨髓來源的DC成熟活化并調節(jié)細胞因子的表達。觀察人工合成β寡糖調節(jié)DC細胞功能可能涉及的細胞信號轉導通路發(fā)現(xiàn)，β寡糖能夠增強DC細胞ERK磷酸化水平，對AKT的活化有抑制作用。
　　前期實驗發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠增強乙肝病毒核心抗原前144個氨基酸的質粒DNA(pB144)疫苗誘導的病毒特異性免疫應答，本