1、乙型肝炎病毒感染是目前全世界面臨的一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)超過20億人已經(jīng)感染了乙肝病毒，其中約3.5億人患有慢性HBV感染。由于HBV感染的高患病率和因慢性乙肝導致的肝癌高死亡率，乙肝因此對我國造成了嚴重的經(jīng)濟負擔。到目前為止，主要有兩大類被FDA批準的用于抗HBV藥物，免疫調(diào)節(jié)劑（IFN-α和PEG-IFN-α）和核苷（酸）的類似物。然而，所有現(xiàn)有的治療方式，都不能完全消除 HBV。即使使用最好的抗病毒藥物，

2、血清學應(yīng)答也不理想，患者需長期用藥，復(fù)發(fā)率高，費用昂貴，此外長期用藥幾乎均會出現(xiàn)耐藥。經(jīng)過多年的發(fā)展，治療性單克隆抗體藥物概念及技術(shù)日漸成熟，在腫瘤及自身免疫病方面已經(jīng)取得了較好的成果。目前，對于HBV的抗病毒治療的研究，主要集中于小分子藥物，尚沒有治療乙肝的抗體藥物進入臨床試驗。傳統(tǒng)上認為抗體只能針對胞外靶標，然而隨著近幾年技術(shù)進步，胞內(nèi)抗體研究受到了廣泛的關(guān)注及快速的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)抗體經(jīng)過適當?shù)姆椒▽爰毎部梢宰饔糜诩毎麅?nèi)靶標并又

3、不同于胞外的作用機制。一般認為，胞內(nèi)抗體主要通過與抗原形成抗原抗體復(fù)合物，從而直接阻斷靶標蛋白發(fā)揮功能，或者影響其亞細胞定位或分泌過程但？抗體入胞方式。廈門大學張軍方博士用穿膜肽攜帶抗體入胞的方式發(fā)現(xiàn)針對HBX蛋白胞內(nèi)抗體具有抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)抗病毒作用是通過形成抗原抗體結(jié)合物后進一步通過Trim21蛋白介導的蛋白降解實現(xiàn)的。該研究啟發(fā)我們，雖然 HBx在增強 HBV復(fù)制及促進肝癌的發(fā)生發(fā)展進程中起著重要的作用，但并不是病毒復(fù)制周期必須的

4、蛋白。HBV感染胞內(nèi)蛋白還有HBVpoL蛋白和HBc蛋白。這兩個蛋白在病毒復(fù)制周期中都是必須的，具有多種必不可少的功能。如果能在胞內(nèi)抑制這兩種蛋白的作用，理論上可以獲得更好的抗病毒效果，開發(fā)針對HBV蛋白的胞內(nèi)抗體可能可以為治療HBV提供新思路。因此本研究以這兩種胞內(nèi)蛋白為靶點，篩選具有胞內(nèi)抗病毒作用的抗體。初步評估抗病毒作用效果、探討胞內(nèi)抗體的作用機制以及該類型的抗體是否具備開發(fā)為臨床藥物的潛力。
　　本研究分為三個部分：第一部

5、分成功原核了表達的HBVpol-aa1-aa192、HBVpol-aa159-aa406片段，表達量非常高，但都以包涵體的形式存在，且很難恢復(fù)為天然構(gòu)象，這可能與HBVpol富含含硫氨基酸有關(guān)。成功獲得了41株反應(yīng)性良好的單克隆細胞，并純化為濃度較高的抗體，為下一步研究擴增了抗體庫。成功獲得了能與真核系統(tǒng)表達的HBVpol全長反應(yīng)的抗體，既有可以和wb反應(yīng)的抗體，也有免疫熒光反應(yīng)性,其中一株抗體P20是目前全世界唯一一株適合用于HBV細

6、胞株中聚合酶WB檢測的抗體。為下一步的研究提供了工具。并且建立了可以檢測細胞裂解液中HBVpol雙抗體夾心的配對抗體。繼續(xù)優(yōu)化后可嘗試檢測血清中HBVpol蛋白。第二部分在轉(zhuǎn)基因小鼠上驗證了HBVpol單抗抗病毒作用，結(jié)果提示幾株抗體具有較好的降低HBV-DNA的效果，最好的一株抗體可以降低小鼠血清滴度約10倍。為了繼續(xù)驗證HBVpol單抗抗病毒效果并研究其機制，構(gòu)建真核表達載體的重組HBVpol單抗。在共轉(zhuǎn)染huh7細胞模型中、HBV

7、穩(wěn)定整合細胞株模型中、 hepaG2-NTCP感染模型中繼續(xù)驗證重組表達抗體的抗病毒作用。結(jié)果顯示各種細胞模型中均對HBeAg水平有比較理想的降低作用.提示這株單抗在細胞內(nèi)也具有很好的抗病毒的作用。為了探究HBVpol單抗抗病毒作用機制，我們觀察了一些細胞內(nèi)固有信號通路的重要分子，發(fā)現(xiàn)NFκB、AP-1、IRSE、IFN-β均被激活。用基因敲除的辦法證明胞內(nèi) Anti-HBVpol單抗發(fā)揮作用主要依賴TRIM21分子。第三部分篩選獲得由