1、鎘(Cadmium)是一種廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有毒重金屬，隨著近年來越來越多有關(guān)鎘污染的報道，人們也越來越關(guān)注鎘對環(huán)境和人類的健康造成的影響。鎘能對多個器官系統(tǒng)造成巨大的危害，包括腎、肝、腦、肺、睪丸及血液等。流行病學研究和動物實驗研究中明確了鎘暴露與多種腫瘤有相關(guān)性，尤其是鎘與肺癌有明顯的關(guān)聯(lián)性，1993年IARC（國際腫瘤研究中心）將鎘列為Ⅰ類致癌物。研究表明，許多癌癥和腫瘤晚期的轉(zhuǎn)移和惡化可能與腫瘤細胞自噬水平改變有關(guān)。自噬通過

2、包裹細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)和衰老細胞器形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體進行降解物質(zhì)實現(xiàn)循環(huán)利用，這一過程受自噬相關(guān)蛋白(Atg)的逐級調(diào)節(jié)，隨后自噬體與溶酶體融合后消化膜內(nèi)容物產(chǎn)生合成大分子和代謝物的物質(zhì)，為細胞提供能量來源。因此，本研究擬探討低濃度鎘誘導的自噬在鎘誘導腫瘤發(fā)生中的可能分子機制。
　　本研究擬以人肺腺癌A549細胞為體外實驗模型，觀察氯化鎘對A549細胞的細胞增殖、細胞遷移和侵襲能力的影響;再通過觀察細胞周期改變及Cycli

3、n-D1表達、細胞內(nèi)活性氧水平，自噬形成及相關(guān)蛋白的表達、細胞遷移侵襲能力變化及相關(guān)蛋白MMP-9蛋白表達，探討可能的分子機制;并采用活性氧(ROS)的清除劑N-乙酰半胱氨酸NAC和Atg4 siRNA干預處理，進一步明確ROS上調(diào)Atg4引起的自噬在氯化鎘誘導A549細胞的細胞增殖、細胞遷移和侵襲中的分子機制，為鎘誘導腫瘤提供預防和治療的理論依據(jù)。
　　目的:研究低濃度氯化鎘對人肺腺癌A549細胞的增殖、細胞遷移和侵襲能力的影響

4、，并探討依賴細胞內(nèi)ROS的自噬途徑在細胞增殖、細胞遷移和侵襲變化過程中的作用機制。
　　方法:以人肺腺癌細胞(A549細胞)作為實驗對象。按實驗設(shè)計，將不同濃度氯化鎘作用于A549細胞，應(yīng)用MTT法測定A549細胞增殖率和不同實驗干預劑NAC、3-MA和Atg4 siRNA預處理后氯化鎘作用于A549細胞增殖率的變化。分別采用透射電鏡和熒光顯微鏡測定A549細胞的自噬水平和自噬溶酶體膜電位的變化。用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(

5、R)Green染色的自噬小體綠色熒光強度的改變。用2'，7'-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH—DA)染色法，在熒光顯微鏡下觀察氯化鎘處理后A549細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的變化，并用NAC預處理2小時，以明確細胞內(nèi)ROS在氯化鎘誘導細胞自噬和增殖中的作用。應(yīng)用Transwell實驗檢測氯化鎘作用后A549細胞的遷移和侵襲的能力改變。用流式細胞儀檢測實驗設(shè)計中不同實驗處理組A549細胞生長周期的變化。運用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，敲除A

6、549細胞自噬相關(guān)基因4(ATG4)，檢測氯化鎘所誘導的細胞自噬對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。用蛋白印跡法(Westem Blot)檢測本實驗中自噬標志蛋白LC3蛋白、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg4蛋白、細胞周期蛋白Cyclin D1以及MMP-9蛋白的表達量。用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:低濃度氯化鎘作用A549細胞48小時后，誘導A549細胞的細胞增殖(P＜0.01)，細胞周期結(jié)果顯示氯

7、化鎘處理組S期和G2/M期細胞百分比例顯著增加，G0/G1期細胞比例減少(P＜0.05)。電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示形成自噬小體數(shù)量增加，熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(R)Green染色的A549細胞自噬小體熒光強度增強，遷移和侵襲細胞數(shù)量增加，并且具有統(tǒng)計學意義。低濃度（2μM）氯化鎘作用于A549細胞后，細胞內(nèi)ROS含量增加，NAC預處理降低了氯化鎘誘導的細胞內(nèi)ROS水平的升高，表明氯化鎘引起了A549細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時，NAC可

8、以有效的抑制氯化鎘的促增殖作用和下調(diào)由氯化鎘誘導表達增加的自噬相關(guān)蛋白LC3和Atg4的表達量，表明氯化鎘通過氧化應(yīng)激誘導了細胞自噬和細胞增殖；自噬抑制劑3-MA和Atg4 siRNA不僅能夠拮抗氯化鎘作用誘導的自噬增加效應(yīng)，還抑制了氯化鎘對A549細胞的促增殖、遷移和侵襲能力，表明Atg4介導的自噬在氯化鎘誘導的A549細胞的細胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用。
　　結(jié)論:低濃度氯化鎘通過誘導A549細胞內(nèi)ROS水平升高、上調(diào)