1、在細(xì)胞的生命活動(dòng)中,蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化有著非常重要的意義。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A,PP2A)作為蛋白磷酸酶家族中十分重要的一員,它與絕大部分真核細(xì)胞的各種調(diào)控都有非常密切的關(guān)系.PP2A作為主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一,其調(diào)節(jié)亞基對(duì)PP2A行使功能具有巨大的作用。為了研究PP2A在低等脊椎動(dòng)物中的功能,運(yùn)用RT-PCR和末端快速擴(kuò)增法,從金魚中克隆到了PP2A調(diào)節(jié)亞基”中β基因的cDNA全長(zhǎng)序

2、列。結(jié)果顯示,從金魚中克隆得到的β基因包括一個(gè)含1746個(gè)核苷酸的開放閱讀框和編碼一個(gè)67KD的蛋白。
　　 試驗(yàn)中利用反義核酸技術(shù)研究PR72/B”/β的功能。反義核酸就是指能夠與特定的mRNA準(zhǔn)確互補(bǔ)、特異性的阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。通過使用反義核酸特異性的使某些基因的表達(dá)被降低或停止,此過程即為反義核酸技術(shù)。其包括三種技術(shù),分別是:反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)。在行使基因下向調(diào)節(jié)作用因子的功能

3、時(shí),反義核酶對(duì)降低一些有害基因的表達(dá)和失去控制的基因的過度表達(dá)起著非常重要的作用。與傳統(tǒng)的基因干擾手段相比,反義核酸具有更多的優(yōu)點(diǎn)。①高度特異性:反義核酸作用于靶RNA或DNA的原理相似于“生物導(dǎo)彈”,通過特異的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用。②高生物活性和豐富的信息量:作為一種含有特定遺傳信息的信息體,反義核酸的堿基排列有著無窮的變化。③高效性:有效并且直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。④低毒、安全:目前的研究并沒有發(fā)現(xiàn)反義核酸的明顯毒性,雖然其在

4、體內(nèi)的停留時(shí)間有長(zhǎng)有短,但最終都會(huì)被降解。反義核酸抑制基因表達(dá)時(shí)具有廣譜性,不僅可以用來抑制酶和受體蛋白,還可以用來傳統(tǒng)方法難以起效的接頭蛋白(adaptor)、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。
　　 在了解PR72/B”/β在金魚胚胎發(fā)育中的具體功能中,利用已經(jīng)克隆到的金魚PR72/B”/β cDNA序列,運(yùn)用相關(guān)的技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的pEGFP反義表達(dá)載體,通過顯微注射的方法將載體注射到金魚的受精卵中,以觀察其對(duì)胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)

5、下調(diào)PR72/B”/β基因的表達(dá)時(shí),在金魚的胚胎時(shí)期發(fā)現(xiàn)了明顯的組織和器官的畸形表型。在出膜期大約有81％的綠色熒光胚胎出現(xiàn)畸形,在顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)在脊椎和尾巴的發(fā)育不全或缺失。這些結(jié)果表明,PP2A調(diào)節(jié)亞基對(duì)組織和器官的生成有著非常重要的作用,PR72/B”/β基因?qū)τ诮痿~胚胎發(fā)育是不可缺少的。在下序的工作中對(duì)畸形的胚胎進(jìn)行了石蠟切片。從切片的結(jié)果可以看出,有超過79％的畸形胚胎的眼睛有明顯的畸形,其中,眼睛晶狀體出現(xiàn)更多