1、目的:觀察胰島細(xì)胞自身抗原蛋白69(Islet cell antigen protein69，ICA69)表達(dá)的改變對實(shí)驗(yàn)動物熱痛、機(jī)械痛和炎癥性疼痛行為的影響，以此判斷ICA69在不同疼痛模型中的作用，即ICA69與疼痛類型之間的關(guān)系，并探討其相關(guān)機(jī)制。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICA69可以顯著炎癥性疼痛動物行為學(xué)，所以進(jìn)一步期望從ICA69缺失與神經(jīng)系統(tǒng)功能和ICA69缺失與炎癥發(fā)生關(guān)系兩個角度，探討研究ICA69影響炎癥性疼痛的具體機(jī)制，

2、為疼痛的診治提供基礎(chǔ)研究的依據(jù)，為進(jìn)一步研發(fā)疼痛治療藥物與疼痛治療方法拓展思路。觀察葛根芩連湯對糖尿病疼痛的治療作用，并基于ICA69進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。
　　方法:(1)統(tǒng)計分析野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在甩尾實(shí)驗(yàn)、Von Frey機(jī)械刺激實(shí)驗(yàn)、甲醛皮下注射炎癥痛實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)結(jié)果，并進(jìn)行比較，觀察ICA69缺失后對3種疼痛行為的影響。(2)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測神經(jīng)系統(tǒng)中ICA69的表達(dá)情況，并通過免疫組織熒光染色(Im

3、munofluorescence staining，IF)得到背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)中ICA69陽性神經(jīng)元的分子特性，并比較與炎癥性相關(guān)的重要分子，包括非選擇性陽離子通道瞬時感受器電位通道V1、A1(Transient receptor potential cation channel V1、A1，TRPV1、TRPAl)和降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene related pepti

4、de，CGRP）在ICA69缺失后，生理狀況下的表達(dá)情況。(3)應(yīng)用蛋白免疫印跡方法(Western blot，WB)檢測炎癥模型動物中ICA69本身在炎癥局部和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫熒光染色比較野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在病理狀態(tài)下炎癥性疼痛相關(guān)分子的表達(dá)情況。(4)提取野生型小鼠和ICA69-/-小鼠炎癥局部皮膚釋放物，以此作為刺激物分別對野生型小鼠和ICA69-/-小鼠的原代DRG神經(jīng)元進(jìn)行鈣離子成像研究，判斷

5、ICA69參與炎癥性疼痛干預(yù)的機(jī)制。(5)根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討ICA69在炎癥發(fā)生過程中的作用及機(jī)制。制備甲醛炎癥疼痛模型后，觀察野生型小鼠和ICA69-/-小鼠局部腫脹情況，以及局部形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測重要的炎癥細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞）中ICA69是否表達(dá)，同時檢測炎癥局部釋放物中腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和

6、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。最后通過甲醛刺激原代巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測ICA69缺失對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活的影響。(6)通過腹腔單次大劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)制備小鼠糖尿病疼痛模型，模型制各后給予葛根芩連湯水煎液灌胃，觀察該方劑對模型小鼠血糖、體重、疼痛行為的影響，并進(jìn)一步檢測其對小鼠胰腺組織ICA69表達(dá)水平和血清炎癥因子水平。
　　結(jié)果:(1)ICA69的缺失能夠顯著減少實(shí)驗(yàn)動

7、物在甲醛所導(dǎo)致的炎癥性疼痛中的疼痛行為(P＜0.01)，但對實(shí)驗(yàn)動物的熱痛行為學(xué)和機(jī)械痛行為學(xué)未見顯著影響。(2)ICA69在外周神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá)，其陽性神經(jīng)元多為小直徑的肽能無髓鞘神經(jīng)元，ICA69的缺失對瞬時電壓門控陽離子通道V1(Transient receptor potential cation channel V1，TRPV1)、瞬時電壓門控陽離子通道A1（Transient receptor potential cati

8、on channel A1，TRPA1）和降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）等在炎癥性疼痛中扮演重要角色的分子表達(dá)無顯著影響。(3)甲醛致痛的模型組小鼠炎癥局部和DRG中ICA69的表達(dá)水平與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，同時ICA69-/-小鼠進(jìn)行造模處理后，TRPV1、TRPA1和CGRP等分子的表達(dá)情況與野生型模型鼠比較亦無顯著性差異(P＞0.05)。(4)鈣離子

9、成像結(jié)果顯示:野生型小鼠和ICA69-/-小鼠DRG神經(jīng)元對相同的刺激物的反應(yīng)無顯著性差異(P＞0.05)，而野生型模型小鼠炎癥皮膚釋放物所引起的神經(jīng)元細(xì)胞反應(yīng)比例顯著高于ICA69-/-模型小鼠(P＜0.05)，提示兩種皮膚釋放物的組成存在顯著差異，ICA69可能參與了炎癥的發(fā)生過程而對神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響不明顯。(5)腫脹度檢測實(shí)驗(yàn)和病理學(xué)染色實(shí)驗(yàn)均提示ICA69缺失后造模，實(shí)驗(yàn)動物炎癥局部腫脹程度顯著降低(P＜0.05);逆轉(zhuǎn)錄PC

10、R結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞中均存在ICA69的表達(dá);ELISA檢測野生型模型鼠和ICA69-/-模型小鼠炎癥局部皮膚釋放物中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，結(jié)果顯示前兩者在ICA69-/-模型小鼠炎癥局部皮膚釋放物中顯著低表達(dá)(P＜0.05);原代細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，進(jìn)行核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示ICA69缺失后，在甲醛和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，與野生型小鼠巨噬細(xì)胞

11、比較，ICA69-/-原代巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活程度顯著降低(P＜0.05)。(6)葛根芩連湯能夠顯著逆轉(zhuǎn)由于STZ造模所引起的動物體重、血糖的改變，同時模型小鼠對熱刺激(P＜0.01)、機(jī)械刺激(P＜0.01)、冷刺激(P＜0.05)的痛閾降低也可以被葛根芩連湯逆轉(zhuǎn)。葛根芩連湯能夠顯著降低造模引起的胰腺組織ICA69表達(dá)增高，同時模型小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β也通過給予葛根芩連湯被顯著降低。
　　結(jié)論: