1、臨床上多種原因可導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體集聚過多，如:支氣管肺泡灌洗、淹溺、心功能不全、急性肺損傷等。目前已研究證實(shí)肺泡內(nèi)液體清除過程主要是由肺泡上皮細(xì)胞主動(dòng)重吸收鈉，再由基底側(cè)細(xì)胞膜上鈉鉀ATP酶將其泵入到肺間質(zhì)，肺泡內(nèi)的水在滲透壓梯度作用下通過上皮細(xì)胞膜的水通道或單純擴(kuò)散進(jìn)入肺間質(zhì)，最后由淋巴管或毛細(xì)血管回吸收。肺泡液體清除率(alveolar Fluid clearance，AFC)與肺水腫之間關(guān)系密切，提高肺泡液體的清除率，可以加速肺泡內(nèi)

2、積聚的液體的清除，促進(jìn)肺水腫液的回吸收，在此過程中，肺泡上皮細(xì)胞項(xiàng)膜上的鈉通道及基底膜上的鈉鉀ATP酶的功能狀態(tài)決定了肺泡上皮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
　　鈉鉀ATP酶是廣泛存在于膜上的異二聚體跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在肺泡液體清除過程中，鈉鉀ATP酶的功能是形成細(xì)胞膜內(nèi)外滲透性梯度差，引起鈉離子順濃度差轉(zhuǎn)運(yùn)，使3個(gè)鈉離子被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的同時(shí)泵入2個(gè)鉀離子。鈉鉀ATP酶在肺泡上皮細(xì)胞膜上表達(dá)增加或其活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)肺泡液體清除。相反，鈉鉀AT

3、P酶在肺泡上皮細(xì)胞膜上低表達(dá)或抑制其活性則導(dǎo)致肺泡液體清除率下降。因此鈉鉀ATP酶的功能是調(diào)節(jié)肺泡上皮功能的一個(gè)重要的和基礎(chǔ)的分子機(jī)制。
　　膽堿能神經(jīng)在肺組織內(nèi)廣泛分布，調(diào)節(jié)著氣道張力、血流供應(yīng)、黏液分泌以及呼吸型式等，膽堿能M型和N型受體在人和鼠類肺泡上皮細(xì)胞上分布，自2000年以來多項(xiàng)研究采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激迷走神經(jīng)方法研究膽堿能神經(jīng)在膿毒癥或非膿毒癥（機(jī)械通氣、缺血再灌注、油酸誘導(dǎo)等）急性肺損傷中的抗炎或抗凋亡作用。最

4、近膜片嵌技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)膽堿能受體激動(dòng)劑卡巴膽堿和oxotremorine能夠劑量依賴性地激活大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉電流，提示膽堿能受體參與調(diào)解了肺泡上皮的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)。臨床上在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗操作時(shí)，如果應(yīng)用M膽堿能受體阻斷劑阿托品能夠增加肺泡液體回吸收量。推測(cè)膽堿能神經(jīng)可能參與調(diào)節(jié)肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)，但目前對(duì)于膽堿能神經(jīng)在肺泡液體清除中的作用尚未見國(guó)內(nèi)外報(bào)道，因此本研究采用了迷走神經(jīng)切斷、電刺激的方法以及外源性給予氯化乙酰膽堿研究了乙酰膽堿在

5、肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，并進(jìn)一步探討了氯化乙酰膽堿與肺泡上皮鈉鉀ATP酶的相互作用，具體內(nèi)容如下:
　　第一部分迷走神經(jīng)干預(yù)對(duì)小鼠肺泡液體清除作用的影響
　　目的:采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激的方法觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，進(jìn)而證明內(nèi)源性乙酰膽堿參與調(diào)解了肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　方法:60只清潔雄性Balb/c小鼠，體重28-30g，隨機(jī)分為4組，每組15只，其中每組中6只用來測(cè)量肺泡液體清除率(AFC)，6只用來測(cè)定

6、血漿中乙酰膽堿的水平，3只用來行HE染色。①假手術(shù)對(duì)照組(Con):左側(cè)迷走神經(jīng)分離，但不處理干預(yù)。②左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(LVAG):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷。③左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激(LVS1):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷，電極刺激其外周端，即傳出神經(jīng)。④左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激(LVS2):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷，電極刺激其中樞端，即傳入神經(jīng)。將含有Evans藍(lán)標(biāo)記的5％白蛋白等滲生理鹽水溶液250ul以每2分鐘一次，每次50ul的速度注入小鼠的肺

7、泡腔內(nèi)，實(shí)驗(yàn)20分鐘后頸動(dòng)脈放血處死小鼠回吸收肺泡內(nèi)剩余液體，用酶標(biāo)儀測(cè)量Evans藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度，根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計(jì)算肺泡液體清除率，以觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。因乙酰膽堿在血漿內(nèi)快速被代謝，我們收集迷走神經(jīng)干預(yù)即刻的血漿標(biāo)本，用南京建成的試劑盒測(cè)量血漿乙酰膽堿的含量，從而間接反映迷走神經(jīng)干預(yù)影響了血漿乙酰膽堿水平。HE染色標(biāo)本收集了灌注后30分鐘的組織標(biāo)本，從形態(tài)學(xué)上觀察迷走神經(jīng)干預(yù)對(duì)肺泡液體清除過程的影響

8、。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，左側(cè)迷走神經(jīng)切斷明顯降低了AFC(66.88±2.64％ VS48.69±2.57％; P＜0.01);與左側(cè)迷走神經(jīng)切斷組相比，左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激明顯升高了AFC(48.69±2.57％ VS60.81±1.96％; P＜0.01);而左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激出現(xiàn)了更為降低的AFC(38.49±1.45％VS48.69±2.57％; P＜0.05)。與對(duì)照組血漿中的乙酰膽堿水平（4.64±0.2

9、5ug/ml）相比，左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(3.59±0.27ug/ml)及左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激（2.98±0.18 ug/ml）血漿中的乙酰膽堿水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而在迷走神經(jīng)外周端刺激組(6.01±0.54 ug/ml)明顯升高，且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組有輕度間質(zhì)水腫;單側(cè)迷走切斷組肺泡腔內(nèi)可見較多粉紅色灌注液，間質(zhì)水腫明顯;外周端刺激組相對(duì)于單側(cè)迷走切斷組間質(zhì)水腫減輕

10、。
　　結(jié)論:
　　1、單側(cè)迷走神經(jīng)切斷降低了AFC，提示迷走神經(jīng)參與調(diào)節(jié)了肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　2、電刺激迷走傳出神經(jīng)而非傳入神經(jīng)能夠逆轉(zhuǎn)降低的AFC，提示迷走神經(jīng)促進(jìn)肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)是通過其傳出神經(jīng)發(fā)揮作用。
　　3、電刺激迷走神經(jīng)外周端明顯升高了血漿乙酰膽堿的水平，提示電刺激迷走神經(jīng)傳出段促進(jìn)肺泡液體清除可能是通過其末梢釋放內(nèi)源性乙酰膽堿發(fā)揮作用。
　　第二部分氯化乙酰膽堿對(duì)肺泡液體清除率及肺組織鈉鉀ATP

11、酶的影響
　　目的:觀察外源性氯化乙酰膽堿對(duì)肺泡液體清除率及其肺組織勻漿鈉鉀ATP酶的影響
　　方法:昆明小鼠75只，隨機(jī)分為5組，每組15只，其中每組中6只用來測(cè)量肺泡液體清除率(AFC)，6只用來留取標(biāo)本測(cè)量鈉鉀ATP酶活性及蛋白表達(dá)，其余3只留HE染色組織標(biāo)本。①正常對(duì)照（control）。②10-4mol/L乙酰膽堿。③10-5mol/L乙酰膽堿。④10-6mol/L乙酰膽堿。⑤10-6mol/L乙酰膽堿+10-6m

12、ol/L阿托品。肺泡腔灌注液為Evans藍(lán)標(biāo)記的5％白蛋白等滲生理鹽水內(nèi)加入上述各組不同濃度的藥物，將灌注液200ul以每次40ul，每2分鐘一次的速度注入昆明小鼠的肺泡內(nèi)，20分鐘后用100ul的微量進(jìn)樣器回吸收肺泡內(nèi)殘余液體，用酶標(biāo)儀測(cè)定Evans藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度，根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計(jì)算肺泡液體清除率。肺組織灌注液調(diào)整為生理鹽水稀釋的不同濃度的氯化乙酰膽堿，收集肺組織標(biāo)本以用來測(cè)定鈉鉀ATP酶的活性（南京建成的試劑盒）、

13、膜上Na，K-ATPα1蛋白(western blot)表達(dá)及HE染色。
　　結(jié)果:1與對(duì)照組相比，氯化乙酰膽堿劑量依賴性增加了AFC，10-4M氯化乙酰膽堿上調(diào)肺泡液體清除率達(dá)到較高值(42.95±2.41％vs57.93±3.21％ P≤0.01)。10-6M阿托品阻斷了10-6M氯化乙酰膽堿上調(diào)AFC的作用(45.17±1.05％ vs48.99±1.42％ P≤0.05)。2對(duì)照組Na，K-ATP酶的活性是3.69±0.1

14、9u/mgprot，在氯化乙酰膽堿刺激組其活性分別是10-4M Ach5.85±0.21 u/mgprot;10-5M Ach5.14±0.22 u/mgprot;10-6M Ach4.4±0.14 u/mgprot，10-4-10-6M氯化乙酰膽堿明顯增加了Na，K-ATP酶的活性(P＜0.05)，10-6M阿托品阻斷了10-6氯化乙酰膽堿對(duì)Na，K-ATP酶的作用(3.12±0.42 u/mgprot vs4.4±0.14 u/mg

15、prot P＜0.05)。3與正常對(duì)照組相比，乙酰膽堿刺激各組肺組織勻漿Na，K-ATPα1蛋白的表達(dá)沒有明顯差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、膽堿能神經(jīng)激動(dòng)劑氯化乙酰膽堿能夠劑量依賴性增加肺泡液體清除率，阿托品能夠阻斷該效應(yīng)。
　　2、氯化乙酰膽堿能夠增加肺組織勻漿Na，K-ATP酶的活性，阿托品同樣能夠阻斷該效應(yīng)。
　　3、氯化乙酰膽堿刺激對(duì)肺組織勻漿上總Na，K-ATPα1的蛋白表達(dá)沒有影響。

16、r>　　第三部分氯化乙酰膽堿對(duì)A549細(xì)胞上Na，K-ATP酶的影響
　　目的:培養(yǎng)肺泡上皮A549細(xì)胞，觀察10-5M氯化乙酰膽堿刺激對(duì)該細(xì)胞膜上Na，K-ATP酶的活性及蛋白表達(dá)量的影響。
　　方法:A549接種至培養(yǎng)皿后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con)，氯化乙酰膽堿刺激組（10-5mol/L），氯化乙酰膽堿加阿托品阻斷組(10-5mol/LAch+10-5mol/L Atr)，分別觀察5分鐘、10分鐘，并用酶活性測(cè)定試劑

17、盒測(cè)量細(xì)胞上Na，K-ATP酶的活性，采用免疫熒光及western-blot方法觀察細(xì)胞膜上Na，K-ATP酶蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1與對(duì)照組相比，10-5M氯化乙酰膽堿刺激明顯增加了Na，K-ATPase的活性，5分鐘時(shí)（3.27±0.23 u/mgprot VS5.34±0.5 u/mgprotP＜0.01），10分鐘時(shí)（3.22±0.11 u/mgprot VS3.91±0.22 u/mgprotP＜0.05）。與氯化乙酰

18、膽堿刺激組相比，加入阿托品阻斷膽堿能M受體后，Na，K-ATPase的活性顯著下降，5分鐘（5.34±0.5 u/mgprot VS3.62±0.29 u/mgprot P＜0.01），10分鐘（3.91±0.22 u/mgprot VS3.27±0.16u/mgprot P＜0.05）。2免疫熒光結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，10-5M氯化乙酰膽堿刺激5分鐘細(xì)胞膜上Na，K-ATPase蛋白的綠色熒光未見明顯差別，細(xì)胞連接基底側(cè)細(xì)胞膜上可見

19、明顯的熒光積聚，提示用藥組基底側(cè)細(xì)胞膜上出現(xiàn)Na，K-ATPase蛋白積聚。3 western-blot結(jié)果顯示:以對(duì)照組灰度值相比，氯化乙酰膽堿刺激5分鐘明顯增加了基底側(cè)細(xì)胞膜上相對(duì)的Na，K-ATPaseα1蛋白含量，與刺激組灰度值相比，膽堿能M受體阻斷劑阿托品阻斷了氯化乙酰膽堿的作用。
　　結(jié)論:
　　1、氯化乙酰膽堿能夠增加A549細(xì)胞鈉鉀ATP酶在基底側(cè)細(xì)胞膜上的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)其在膜上的活性。
　　2、氯化乙