1、前言：
　　腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族（TRAFs）包括TRAF1-7，在多種生物進(jìn)程（如固有免疫和炎癥）中發(fā)揮重要作用，影響細(xì)胞增殖和分化。據(jù)報(bào)道，TRAFs是腫瘤壞死因子受體以及IL-1R/TLR超家族的重要的信號傳導(dǎo)分子。TRAF4是其中相對特殊的一員，它有一些迥異于其他成員的特點(diǎn)，比如它擁有三個富含半胱氨酸的基序，與環(huán)指結(jié)構(gòu)和TRAF結(jié)構(gòu)相連;它擁有核定位信號。有研究證實(shí)TRAF4參與NF-κB和JNK信號通路。人類蛋白

2、質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)被分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型PRMTs(PRMT1，3，4，6，8)催化形成單甲基精氨酸(MMA)和非對稱性二甲基精氨酸(aDMA);Ⅱ型PRMTs(PRMT5，7，9)催化形成單甲基精氨酸和對稱性二甲基精氨酸(sDMA)。PRMT5涉及一系列生物學(xué)進(jìn)程，例如核糖體的生物合成，高爾基體形成，細(xì)胞分化及干細(xì)胞分化。PRMT5發(fā)揮功能的部位在不同的疾病中并不一致，在人類前列腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中，其主要定位于胞漿

3、并促進(jìn)細(xì)胞增殖，而在卵巢癌細(xì)胞中，其主要定位于胞核并促進(jìn)細(xì)胞增殖。2006年Rozan LM報(bào)道了TRAF4可以與PRMT5相結(jié)合，但二者在乳腺癌組織中的表達(dá)，其關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)，以及二者之間的調(diào)控關(guān)系都未可知。
　　目的
　　研究了TRAF4和PRMT5在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)因素之間的關(guān)系，二者的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，以及在乳腺癌中的調(diào)控關(guān)系。我們推測PRMT5是乳腺癌預(yù)后的指征之一。
　　方法：
　　1、

4、免疫組化
　　分析43例乳腺正常組織，47例乳腺原位癌，114例乳腺癌組織中TRAF4與PRMT5的表達(dá)、二者相關(guān)性以及與臨床病理學(xué)因素間的關(guān)系。這些標(biāo)本收集自中國醫(yī)科大學(xué)1999年7月至2008年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，事先征得了患者同意并得到倫理委員會對于臨床材料用于研究的同意。臨床病理學(xué)因素包括患者年齡，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期，生物學(xué)標(biāo)記物(ER、PR、HER2)等。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　

5、正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。于37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。MCF-10A細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（20ng/ml表皮生長因子），MCF-7細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDA-MB-231細(xì)胞于L15培養(yǎng)基培養(yǎng)，上述培養(yǎng)基均加10％胎牛血清和1％青-鏈霉素。
　　3、免疫共沉淀
　　應(yīng)用碧云天免疫共沉淀試劑盒檢測TRAF4與PRMT5的結(jié)合狀況。

6、r>　　4、免疫熒光染色
　　應(yīng)用Earthox熒光二抗對MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，檢測TRAF4與PRMT5的共定位。
　　5、轉(zhuǎn)染
　　于Addgene購買TRAF4全長及突變體質(zhì)粒，Origene購買PRMT5質(zhì)粒，廣州銳博公司構(gòu)建TRAF4及PRMT5小干擾RNA，應(yīng)用Attractene轉(zhuǎn)染試劑或HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑對MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。
　　

7、6、核漿分離
　　應(yīng)用Thermo核漿分離試劑盒對處理后的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行核漿分離，以檢測所需指標(biāo)在細(xì)胞核和細(xì)胞漿的不同表達(dá)。
　　7、Western blot
　　應(yīng)用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染TRAF4前后，PRMT5的變化和細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)PRMT5的變化:檢測干擾TRAF4前后PRMT5的變化和細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)PRMT5的變化。
　　8、MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　分

8、析細(xì)胞的相對增殖能力。MTT實(shí)驗(yàn)于490nm波長連測五天細(xì)胞數(shù)繪制增殖曲線，克隆形成實(shí)驗(yàn)分別種不同處理組的MCF-7或MDA-MB-231于3cm孔板，每板1000個，10-12天后染色拍照。
　　9、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、PRMT5和TRAF4在乳腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，PRMT5高表達(dá)提示預(yù)后

9、不良
　　免疫組化結(jié)果顯示，PRMT5和TRAF4在乳腺癌中高表達(dá)。PRMT5與組織學(xué)分型和腫瘤大小有關(guān)(p＜0.05）。PRMT5與TRAF4表達(dá)正相關(guān)(p＜0.01)。
　　Kaplan-Meier生存分析顯示PRMT5高表達(dá)的患者預(yù)后不良(p＜0.01)。Western blot結(jié)果顯示，在28對乳腺癌組織與配對癌旁正常組織中，TRAF4和PRMT5在乳腺癌組織中均高表達(dá)，TRAF4和PRMT5在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7

10、和MDA-MB-231中表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A。
　　2、TRAF4和PRMT5存在共定位，TRAF4的鋅指結(jié)構(gòu)域是二者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)
　　免疫熒光激光共聚焦結(jié)果顯示，TRAF4和PRMT5在乳腺癌細(xì)胞中存在共定位。免疫共沉淀結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中TRAF4和PRMT5可以相互結(jié)合，且二者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)是TRAF4的鋅指結(jié)構(gòu)域。
　　3、TRAF4上調(diào)PRMT5和

11、NF-κB p65的核表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中上調(diào)TRAF4表達(dá)，PRMT5表達(dá)增多(p＜0.05)。在MDA-MB-231細(xì)胞中下調(diào)TRAF4表達(dá)，PRMT5表達(dá)減少(p＜0.05)。而當(dāng)我們改變PRMT5的表達(dá)，對TRAF4的表達(dá)沒有顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞系中上調(diào)TRAF4的表達(dá)，PRMT5的熒光染色更亮，說明PRMT5的表達(dá)有增多的趨勢。進(jìn)一步核漿分離的結(jié)果顯示，T

12、RAF4對于PRMT5的上調(diào)作用主要表現(xiàn)在細(xì)胞核，同時我們發(fā)現(xiàn)，在TRAF4表達(dá)增多時，NF-κB p65的核表達(dá)增多(p＜0.05）。
　　4、TRAF4激活NF-κB信號通路依賴PRMT5的表達(dá)
　　核漿分離的結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染TRAF4的同時干擾PRMT5的表達(dá)，將會使轉(zhuǎn)染TRAF4增多的NF-κB p65表達(dá)被阻滯在細(xì)胞漿(p＜0.05)。免疫共沉淀結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中PRMT5可

13、以與NF-κB p65結(jié)合，免疫沉淀結(jié)果顯示PRMT5可以使NF-κB p65發(fā)生甲基化。
　　5、TRAF4促進(jìn)細(xì)胞增殖依賴PRMT5的表達(dá)
　　MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中，轉(zhuǎn)染TRAF4可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而干擾PRMT5組和轉(zhuǎn)染TRAF4同時干擾PRMT5組細(xì)胞中增殖被抑制(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　在乳腺癌組織和細(xì)胞系中TRAF4和PRMT5過表達(dá)