1、通過比較NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BmNPVT3株和SC7株的序列得知，不同地區(qū)的BmNPV基因組序列存在一定差異，并且大的差異主要位于bro(baculovirusrepeatedopenreadingframes)基因家族所在的區(qū)域。bro家族是一類在昆蟲桿狀病毒科中出現(xiàn)的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷貝，且在堿基序列上也有明顯不同。近年來，有關(guān)BmNPVbro基因的研究較多，學(xué)者們認(rèn)為bro基因在病毒侵染宿主的過程中具有一定的功能。

2、BmNPVT3株基因組中存在bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e5個(gè)拷貝，它們分布于基因組的三個(gè)區(qū)域。我們研究發(fā)現(xiàn)，BmNPVCQ1株在基因組的第二個(gè)區(qū)域缺失bro-b基因，GD株在基因組的第三個(gè)區(qū)域缺失bro-e基因。本研究以BmNPVGD株為研究材料，對(duì)其進(jìn)行了空斑純化，并對(duì)其bro基因家族進(jìn)行了克隆分析，對(duì)bro基因的功能和進(jìn)化進(jìn)行了探討。 1.BmNPVGD分離株空斑克隆株系的建立及驗(yàn)證以家蠶胚胎細(xì)

3、胞系(BmE-SWU1)為病毒培養(yǎng)載體，利用中性紅染色的方法對(duì)BmNPVGD株進(jìn)行了空斑克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得GD株空斑克隆株系。根據(jù)BmNPVCQ1株基因組序列的單核苷酸多態(tài)性分析，選出其中SNP位點(diǎn)較多的gcn2(GeneralControlNonderepressible2)基因，用于驗(yàn)證BmNPVGD株空斑克隆株系的純粹性。分別從BmNPVGD株和空斑克隆株的基因組中擴(kuò)增gcn2基因，經(jīng)T-克隆后測(cè)序；將兩株病毒的gcn2基因分

4、別進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)GD株gcn2基因的潛在SNP位點(diǎn)有2個(gè)，而空斑克隆后的病毒株5條gcn2基因序列比較后則未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，說明空斑克隆株經(jīng)純化后，病原基因組的純粹性得到提高，病原得到了純化。 2.bro基因的同源性分析分析bro基因在各病毒株基因組中的分布情況，bro基因主要分布在基因組的三個(gè)區(qū)域，以T3基因組的bro分布為標(biāo)準(zhǔn)，CQ1株在第二個(gè)區(qū)域缺失bro-b基因，GD株在第三個(gè)區(qū)域缺失bro-

5、e基因，而bro-d基因在幾株病毒中都存在。以BmNPVGD株空斑克隆株的基因組為模板，擴(kuò)增出bro-a，RegionⅡ(主要包括bro-b和bro-c基因)，bro-d三個(gè)片段。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中BmNPVbro基因序列及本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的CQ1株的bro基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明BmNPVGD株bro基因存在插入及缺失，bro基因同源性較高，差異主要集中在其氨基酸序列的N端部分。經(jīng)ANTHEPRO5.0軟件預(yù)測(cè)GD株BRO蛋白

6、均無跨膜區(qū)和信號(hào)肽。 3.bro基因的系統(tǒng)發(fā)育分析與功能分析采用鄰接法進(jìn)行的bro基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GD株bro基因分別位于3個(gè)亞組中，GD株bro-d與日本T3株、重慶CQ1株bro-d以及法國(guó)SC7株bro-Ⅲ屬于亞組A；其bro-a,c與T3株、CQ1株bro-a,c以及SC7株bro-Ⅱ?qū)儆趤喗MB；其bro-b與T3株、CQ1株bro-b,e以及SC7株bro-Ⅰ屬于亞組C，C亞組的bro基因與A亞組和B亞組的br

7、o基因具有較大的進(jìn)化分歧，bro基因進(jìn)化與地理位置的相關(guān)性不明顯。根據(jù)bro基因在四個(gè)不同株系基因組中的位置特征，進(jìn)一步支持了Kang等的觀點(diǎn)：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互間功能互補(bǔ)。同時(shí)推測(cè)bro-b和bro-e功能可能是互補(bǔ)或相同，SC7株的3個(gè)bro基因可能是BmNPVbro家族出現(xiàn)的最簡(jiǎn)約形式。另外，GD株BRO蛋白N端序列符合前人發(fā)現(xiàn)的保守序列模式，但也發(fā)現(xiàn)其C端也是高度保守的。在GD株和CQ