1、大菱鲆是一種非常名貴的海洋魚種，它生長(zhǎng)迅速并且味道十分鮮美，從而深受人們的喜愛。然而，目前魚類的病害問題已成為限制海水魚類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素，其中哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖動(dòng)物(魚、蝦)的重要致病菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 為解決養(yǎng)殖魚的病害問題，增強(qiáng)養(yǎng)殖種類的抗病力，必須對(duì)病原菌和魚類免疫系統(tǒng)之間的相互作用關(guān)系有全面的了解。然而，魚類的許多免疫/抗病相關(guān)基因尚不清楚。由于大多數(shù)免疫/抗病相關(guān)基因并非組成型表達(dá)，而

2、是受病原物感染影響的誘導(dǎo)型表達(dá)，因此如能分析免疫細(xì)胞基因在病原物感染時(shí)的差異表達(dá)，就有可能發(fā)現(xiàn)和鑒別新的免疫/抗病相關(guān)基因，并在分子水平上闡明免疫細(xì)胞和病原菌之間的相互作用關(guān)系。 抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)是Diatchenko等以mRNA差別顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的篩選未知的差異表達(dá)基因的新技術(shù)，它主要基于抑制PCR，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化(normalizat

3、ion)和消減雜交(subtractive hybridization，SH)技術(shù)。它克服了mRNA差異顯示技術(shù)的假陽(yáng)性高和代表性差別分析法的消減雜交輪次較多的缺點(diǎn)，十分適用于分析造成某種特殊表性的目的基因及其功能，從而成為差異表達(dá)基因篩選最有潛力的新方法。 本文運(yùn)用SSH技術(shù)比較了經(jīng)哈維氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆差異表達(dá)基因。利用Trizol試劑分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中提取腎組織和脾組織的總RNA，將同一組的總RNA混合并分

4、離、純化mRNA，構(gòu)建雙向SSH差減文庫(kù)，克隆差減片斷，對(duì)陽(yáng)性克隆片斷測(cè)序分析及GetiBank同源性檢索。共鑒定出49個(gè)差異片段，通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些基因片段大部分為免疫相關(guān)基因，包括主要組織相容性復(fù)合體基因、熱激蛋白基因、信號(hào)蛋白基因等。其中，一個(gè)差異片段被證實(shí)為主要組織相容性復(fù)合體MHC class I a基因(登陸號(hào)EF032639)，通過RACE技術(shù)獲得其全長(zhǎng)的cDNA，測(cè)序并分析其編碼產(chǎn)物的性質(zhì)。該基因

5、序列全長(zhǎng)1466bp，包含一個(gè)1062 bp的開放閱讀框，編碼354個(gè)氨基酸。5’UTR長(zhǎng)127 bp，3’UTR長(zhǎng)277 bp，并且在3’UTR區(qū)poly-A尾1185 bp處含有一多聚腺苷酸信號(hào)序列ATTAAA。經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，MHC class Ia氨基酸序列與牙鲆、青鳉魚、虹鱒、大西洋真鱈、紅鰭東方純、雞、鼠、和人的同源性分別為68％，54％，51％，52％，57％，33％，29％，29％。熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體

6、系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過檢測(cè)PCR產(chǎn)物中熒光訊號(hào)強(qiáng)度來(lái)達(dá)到定量的目的，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。本文采用了SYBR Green I熒光染料，通過相對(duì)定量中的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以大菱鲆看家基因β-actin為內(nèi)參進(jìn)行校正，比較了經(jīng)哈維氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆中MHC class Ia基