1、目的:檢測(cè)青蒿琥酯(artesunate，ART)對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚增生性瘢痕上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)、整合素β1(integrinβ1，ITGB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrixmetalloprotein-1，MMP-1)表達(dá)的影響，探討ART對(duì)瘢痕上皮細(xì)胞的影響。
　　方法:1.收集行手術(shù)切除的皮膚增生性瘢痕組織，通過(guò)中性蛋白酶消化法

2、揭取人皮膚增生性瘢痕表皮，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。利用胰酶消化時(shí)間差，去除成纖維細(xì)胞后獲得純度較高的上皮細(xì)胞細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用抗細(xì)胞角蛋白及波形蛋白抗體免疫組化染色對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源鑒定。將分離純化獲得的瘢痕上皮細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)青蒿琥酯干預(yù)24 h后對(duì)人皮膚增生性瘢痕上皮細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)用倒置顯微鏡觀察青蒿琥酯作用后細(xì)胞形態(tài)的變化。

3、r>　　3.熒光定量RT-PCR法檢測(cè)不同濃度青蒿琥酯對(duì)瘢痕上皮細(xì)胞TGF-β1、ITGB1、MMP-1 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　4.Western Blot法于蛋白層面檢測(cè)青蒿琥酯作用后上皮細(xì)胞TGF-β1及ITGB1表達(dá)情況。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-1蛋白含量的變化。
　　結(jié)果:1.瘢痕上皮細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁生長(zhǎng)，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞多為多角形，細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)排列緊密，呈鋪路石樣。免疫組

4、織化學(xué)抗角蛋白抗體染色呈陽(yáng)性，抗波形蛋白抗體染色陰性。
　　2.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。150μM濃度組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。用藥組之間兩兩比較，除了150μM濃度組與300μM濃度組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。據(jù)此下述實(shí)驗(yàn)設(shè)置的青蒿琥酯濃度組分別為:0、3

5、00、600，1200，2400μM。
　　3.鏡下觀察發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯作用后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生不同程度變化，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞變圓，胞漿變少，且隨著濃度升高變化越明顯。
　　4.熒光定量RT-PCR檢測(cè)顯示青蒿琥酯作用后，人皮膚增生性瘢痕上皮細(xì)胞TGF-β1、ITGB1 mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而MMP-1的mRNA表達(dá)則呈不同程度的上升，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、（P＜0.05）。各用藥組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.Western Blot法檢測(cè)顯示:不同濃度青蒿琥酯作用后，瘢痕上皮細(xì)胞的TGF-β1、ITGB1的表達(dá)水平呈不同程度下降，300μM濃度組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各用藥組之間兩兩比較，除300μM濃度組與600μM濃度組ITGB1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.0

7、5)，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.ELISA法檢測(cè)顯示:不同濃度青蒿琥酯作用后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-1蛋白含量呈不同程度的上升，各濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各用藥組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.通過(guò)酶消化法能成功獲得人皮膚增生性瘢痕上皮細(xì)胞，可經(jīng)胰酶消化去除雜質(zhì)細(xì)胞從而獲得較純的上皮細(xì)胞。
　　2.青蒿琥酯對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚增生性瘢痕