1、目的：G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRK）是一類能使G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）快速脫敏（desensitization）的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族分子，其基本功能是特異性地磷酸化 GPCR，使其快速脫敏與 G蛋白解偶聯(lián)，同時招募β–Arrestin并與之結合，從而阻斷GPCR介導的信號轉導通路。在哺乳動物中GRK家族共有7個成員，根據(jù)結構和功能的相似性分為3個亞家族，GRK4屬于GRK4亞家族。在GRK家族中，GRK4的變異率最大，有多個剪接變異

2、體，其組織表達呈高度選擇特異性，參與多種疾病的致病機制，如原發(fā)性高血壓、多巴胺受體介導的神經(jīng)源性疾病、卵巢癌和乳腺癌等。目前，對于GRK4的了解知之甚少，而關于GRK4在組織器官的分布情況亦缺乏詳盡的研究。因此，筆者選取大鼠作為實驗動物模型來研究 GRK4基因的表達特征及功能，以期為之后的深入研究奠定良好的基礎。
　　方法：1.大鼠組織GRK4的表達特征：1）用Trizol提取不同年齡段大鼠卵巢組織和同只大鼠主要組織總RNA，逆轉

3、錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR技術從RNA水平檢測GRK4的表達特征；2）用加入抑蛋白酶肽、亮抑酶酞、PMSF的 RIPA蛋白裂解液提取組織總蛋白，采用 Western免疫印跡技術從蛋白水平檢測 GRK4在不同年齡大鼠各組織中的表達情況。2. GRK4基因及其新剪接變異體的獲取和克隆：根據(jù)GenBank里大鼠GRK4基因序列設計特異性全長擴增引物；根據(jù)Western blot檢測結果，用Trizol提取大鼠睪丸和附睪組織總RNA

4、，逆轉錄合成cDNA，二次PCR擴增出純度較高的大鼠GRK4基因及其剪接變異體DNA，電泳鑒定；回收電泳瓊脂糖凝膠中多個不同分子量的條帶，TA克隆，藍白斑篩選，隨機選取陽性克隆經(jīng) PCR鑒定后，小提質粒送測序；使用 NCBI- BLAST工具（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）將所得序列與GenBank中己有序列進行比對分析，使用NCBI-Spidey工具(http://www.nebi.

5、nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey)在線分析有效序列各外顯子組成及位置。
　　結果：1.大鼠組織GRK4的表達特征：1）通過實時熒光定量PCR技術檢測GRK4基因的表達情況，結果顯示：①大鼠卵巢中GRK4基因的表達水平隨卵巢發(fā)育成熟而變化；②GRK4基因主要表達于大鼠卵巢、腎臟、心和骨骼肌組織。2）通過Western blot檢測GRK4蛋白的表達情況，結果顯示 GRK4在大鼠的胸腺、睪丸

6、、附睪、心和腦組織有較高表達，不同發(fā)育階段其表達情況也不同。2.使用PCR技術擴增出大鼠GRK4基因及其新剪接變異體，TA克隆后送測序，經(jīng)過比對分析獲得2個在GRK4開放閱讀框架內(nèi)的新剪接變異體，命名為GRK4 variant X1和GRK4 variantX2。
　　結論：（1）從時間特異性角度，通過對不同年齡段卵巢組織的研究發(fā)現(xiàn) GRK4的表達水平隨著卵巢組織的發(fā)育程度而變化，提示其與組織生長發(fā)育調(diào)控有關；從空間特異性角度，G