1、Xa21是一種抗水稻白葉枯病的基因，編碼一個類受體蛋白激酶，在分子生物學(xué)和遺傳育種方面具有重要的研究價值，它的蛋白產(chǎn)物XA21的亞細胞定位是整個研究體系的重要內(nèi)容。 XA21蛋白質(zhì)從C-端到N-端，主要由絲/蘇氨酸激酶區(qū)(STK)、跨膜區(qū)(TM)、富亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)和N-末端信號肽區(qū)(PSS)等結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，推斷認為，跨膜區(qū)或者連同信號肽一起可能對XA21蛋白質(zhì)的亞細胞定位起決定作用。本研究采用融合綠色熒光蛋白標簽法，確定X

2、A21蛋白質(zhì)的亞細胞定位并鑒定對定位起決定作用的結(jié)構(gòu)域。 本試驗根據(jù)Xa21的序列克隆了5個目的基因片段，從大到小依次命名為，Xa21FL(完整的Xa21cDNA*克隆)、Xa212115、Xa211971、Xa211911、Xa21381，物理大小分別是3126bp、2115bp、1971bp、1911bp、381bp。它們的5'-末端都是從Xa21cDNA*的起始密碼子ATG開始、3'-末端逐次缺失那些被認為是重要結(jié)構(gòu)域的基

3、因編碼區(qū)。所有克隆都包含有48bp的c-Myc及銜接頭序列，Xa21FL就是在原Xa21cDNA的序列中加入了c-Myc序列，因而標記為Xa21cDNA*，二者實際上完全相同。Xa21FL采用重組PCR方法去除中間一段內(nèi)元拼接兩段外元而獲得。就上述克隆片段對應(yīng)的表達產(chǎn)物而言，除XA21全蛋白外，其余4個蛋白質(zhì)自C-末端起逐次缺失絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)(STK)、跨膜區(qū)(TM)、富亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)小部分、富亮氨酸重復(fù)區(qū)絕大部分。將克隆

4、的5個目的基因片段融合在GFpS65T(Ser65用Thr替代)編碼序列的5'-端，構(gòu)建融合GFPS65T蛋白基因的表達載體，連同對照的GFPS65T蛋白基因載體pGFPS65T，通過基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，培養(yǎng)24小時～48小時，用激光共聚焦顯微鏡檢測法采集熒光圖像，進行定位分析。由此，本試驗得到以下結(jié)果： 1.采用重組PCR方法克隆了Xa21FL(Xa21cDNA*)；2.構(gòu)建了5個融合目標基因片段的GFPS65T蛋白基因表

5、達載體，pXa21381-GFPS65T，pXa211911-GFPS65T，pXa211971-GFPS65T，pXa212115-GFPS65T，pXa21FL-GFPS65T； 3.熒光圖像定位分析表明，對照的熒光在整個細胞中都有分布，證明GFPS65T沒有細胞分布的特定傾向，不會對融合蛋白的定位產(chǎn)生影響；XA21融合全蛋白熒光集中在質(zhì)膜上，從而亞細胞定位XA21蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上； 4.用反差法檢驗相應(yīng)結(jié)構(gòu)域缺失后的