1、E2蛋白是豬瘟病毒的跨膜結(jié)構(gòu)糖蛋白，是最易發(fā)生變異的一種蛋白，能誘導(dǎo)感染動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性免疫和豬瘟病毒中和抗體，是一種免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，其中A1、B、c區(qū)對(duì)介導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生很重要，用A1和B或A1和C的單抗可見協(xié)同中和反應(yīng)。表達(dá)CSFV Brescia株E2蛋白重組偽狂犬病毒以及用親和層析法從昆蟲細(xì)胞中的基因工程E2蛋白均能保護(hù)免疫豬抵抗豬瘟病毒的感染，可以確定E2蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)足以保護(hù)免疫豬抵抗豬瘟病毒的感染。為制備豬瘟病毒E2蛋白的

2、抗體，研究E2基因表達(dá)產(chǎn)物在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用及E2蛋白的中和性抗原表位，我們進(jìn)行了豬瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表達(dá)。 首先根據(jù)GenBank中登錄的豬瘟病毒基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒(PGEX-4T-1-PE2)中擴(kuò)增出大小約為622bp的基因；經(jīng)單酶切鑒定，與已知的豬瘟病毒E2基因含有相同的Dra Ⅰ酶切位點(diǎn)。P

3、CR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T 載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α，經(jīng)菌液PCR篩選出陽性重組克隆PMD18-T-TE2，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的克隆到豬瘟病毒TE2基因。 其次，根據(jù)所克隆的豬瘟病毒TE2基因序列和原核表達(dá)載體PGEX-4T-1多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒PMD18-T-TE2中擴(kuò)增出長(zhǎng)約622bp的豬瘟病毒TE2基因，編碼包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原區(qū)域A、B、C和D。再將擴(kuò)增

4、的豬瘟病毒TE2基因克隆到原核表達(dá)載體 PGEX-4T-1中，經(jīng)質(zhì)粒 PCR和EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-TE2。然后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (EcoliRosetta (DE3) BL21，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表達(dá)出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與TE2的融合蛋白GST-TE2，融合蛋白的分子量約為47.0KD，與預(yù)期結(jié)果相符。通過優(yōu)化原核表達(dá)

5、條件，確定了原核表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度。對(duì)表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物GST-TE2融合蛋白以包涵體形式存在。我們用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對(duì)含有PGEX-4T-1-TE2質(zhì)粒的Rosetta(DE3)BL21菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，反復(fù)凍融和超聲方法裂解誘導(dǎo)菌，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，F(xiàn)olin-酚法測(cè)定提取的融合蛋白 GST-TE2濃度約為 1.2mg/ml。應(yīng)用提取的GST-TE2融合蛋白作為

6、抗原免疫小鼠制備鼠抗豬瘟病毒TE2多克隆抗體。瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)表明制備的多抗具有良好的反應(yīng)性，ELISA實(shí)驗(yàn)表明鼠多抗的有效稀釋度可達(dá)1：25600，免疫印記(Western-blotting，WB)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼠抗豬瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗體和抗融合蛋白GST-TE2抗體。 綜上所述，本研究成功地克隆了豬瘟病毒TE2基因，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-1-TE2并進(jìn)行了原核表達(dá)，提取了融合蛋白GST-TE2，并且