1、微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)明顯受益于異源表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,通過(guò)把來(lái)源于原始菌株的生物合成基因?qū)牒线m的新宿主菌株中,可以更容易地進(jìn)行基因操作,研究沉默基因的功能和設(shè)計(jì)新的化合物,可以解決原始菌株難培養(yǎng)的問(wèn)題以提高次級(jí)代謝物的產(chǎn)量,而且由于宿主菌比較清晰的代謝背景可以簡(jiǎn)化次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取工藝等。目前,微生物復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物的多酶復(fù)合體基因異源表達(dá)方面研究最為深入的是聚酮類化合物。
　　 聚酮化合物成功地異源表達(dá)需要一個(gè)合適的宿

2、主菌,假單胞菌(Pseudomonas)由于生長(zhǎng)快,可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵,G+C組成高,有成熟的遺傳操作系統(tǒng),有適合聚酮化合物異源表達(dá)的修飾系統(tǒng)等優(yōu)勢(shì)成為聚酮化合物異源表達(dá)的首選宿主之一。相當(dāng)多的聚酮化合物的合成需要以甲基丙二酰輔酶A(methylmalonylCoA)作為延伸單位,而Pseudomonas本身不能產(chǎn)生mmCoA,因此本研究通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建能產(chǎn)生mmCoA的假單胞工程菌。在微生物中mmCoA可以通過(guò)兩條途徑合成,一個(gè)是

3、PCC途徑,由丙?；o酶A羧化酶催化丙?；o酶A生成;另一個(gè)是MCM途徑,琥珀酰輔酶A由甲基丙二酰輔酶A變位酶和差向異構(gòu)酶催化生成。
　　 在本研究中利用兩種途徑來(lái)產(chǎn)生mmCoA,PCC途徑由來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor A3(2))編碼丙酰基輔酶A羧化酶a亞單元的accA1基因和編碼丙?；o酶A羧化酶β亞單元羧基轉(zhuǎn)移酶的pccB基因組成;來(lái)源于惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT

4、2440)rpe和trpE基因片段作為同源重組片段;來(lái)源于pACYC177的kan基因(卡那霉素抗性基因),以上五個(gè)基因構(gòu)建成順序?yàn)閑pi-kan-epi-mcm-argK-trpE的基因盒,將所構(gòu)建的基因盒克隆到載體pEX100TlinK上構(gòu)建成整合質(zhì)粒,通過(guò)三親雜交的方法把基因盒整合到P.putida KT2440基因組中,得到雙交換子,命名為P.putida LS-PCC;MCM基因簇由來(lái)源于E.coli的編碼甲基丙二酰輔酶A變位

5、酶sbm基因,編碼甲基丙二酰輔酶A變位酶復(fù)合物保護(hù)蛋白的argK基因和源于S.coelicolor A3(2)的編碼差向異構(gòu)酶的epi基因三個(gè)基因組成,用同樣的方法擴(kuò)增kan基因和同源區(qū)域,共六個(gè)基因組成rpe-kan-epi-sbm-argK-trpE的基因盒,以同樣方法把MCM基因簇整合至P.putidaKT2440基因組中得到雙交換子命名為P.putida LS-MCM。
　　 氣相色譜和質(zhì)譜連用分析表明P.putida

6、LS-PCC和P.putida LS-MCM均能產(chǎn)生mmCoA,產(chǎn)量分別達(dá)2.49 nmol/mL和2.22 nmol/mL。
　　 雷帕霉素(Rapamycin)是由吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)產(chǎn)生的31元大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合物,具有免疫抑制作用,1999年正式作為免疫抑制劑藥物使用,除此之外它還具有抗真菌,抗腫瘤活性,最近的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有延長(zhǎng)小鼠、酵母、線蟲(chóng)、果蠅壽命,還可一定的恢復(fù)患有阿爾茨海默類似癥狀

7、實(shí)驗(yàn)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,因此雷帕霉素及其類似物是一類具有藥用潛力的化合物。雷帕霉素原始生產(chǎn)菌株基因操作困難、產(chǎn)雷帕霉素能力低下、發(fā)酵周期長(zhǎng)及高濃度產(chǎn)物和底物抑制等問(wèn)題制約著雷帕霉素的研究開(kāi)發(fā),因此異源表達(dá)雷帕霉素是很有必要的。S.hygroscopicus NRRL5491中雷帕霉素生物合成基因簇已經(jīng)測(cè)序,基因簇為107.3 kb,其中聚酮合酶(PKS)基因約80 kb,包含3個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(rapA、rapB、rapC),在PKS基

8、因兩側(cè)有24個(gè)編碼框,主要編碼雷帕霉素后修飾和合成中一些關(guān)鍵步驟所需的酶。
　　 本實(shí)驗(yàn)中,選擇合適的限制性內(nèi)切酶酶切S.hygroscopicus NRRL5491的總基因組,利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離酶切的片段,以特異性的rapP基因片段作為探針通過(guò)Southern雜交在凝膠上定位含有完整生物合成基因簇的片段,確定基因簇存在于兩個(gè)相距約360 kb的XbaI酶切位點(diǎn)之間。并設(shè)計(jì)了克隆雷帕霉素生物合成基因簇的Red/ET重組策略,