1、重組工程(Red/ET,recombinationmediatedgeneticengineering)是指由重組酶催化的DNA短片段之間的同源重組而在大腸桿菌中進行基因克隆或改造的一種技術。重組工程可以在基因片段的任意位點進行準確的敲入、敲除、置換,并且不受酶切位點的限制,現(xiàn)已逐漸成為常規(guī)的克隆手段。
　　 重組工程中的重組酶主要是來源自λ噬菌體三個基因,其中redα(exo)編碼DNA5'端至3'端的外切酶,其作用于雙鏈DN

2、A分子而產生3'端突出的分子;redβ(bet)編碼單鏈結合蛋白,其結合在DNA分子的3'突出端,還具有重組酶活性,促進兩個單鏈、同源DNA分子之間的退火產生重組DNA;redy(gam)基因的作用是抑制大腸桿菌RecBCD對外源DNA的降解。
　　 目前主要應用的兩種重組工程系統(tǒng)都是基于red基因構建的。第一種系統(tǒng)是前噬菌體系統(tǒng),以美國國立癌癥研究所DonaldCourt實驗室構建的大腸桿菌DY380為代表。是將缺陷九前噬菌體

3、整合至大腸桿菌基因組中構建而成,重組酶基因由P1啟動子所誘導。
　　 在DY380中,red基因由PL啟動子嚴格調控,30℃時,PL啟動子被溫度敏感性抑制子cI857抑制,42℃時抑制解除。因此在DY380中,重組酶的表達是由30℃轉移至42℃時的溫度升高所誘導的。此系統(tǒng)的缺點是菌株需要在30℃生長,比在37℃下生長要慢;其次,重組酶的表達需要42℃水浴進行15分鐘精確的熱誘導。
　　 第二種是基于質粒的重組酶系統(tǒng),最常

4、使用的兩個質粒是pKD46(氨芐青霉素抗性)和pSC101-BAD-gbaA(四環(huán)素抗性)載體。在這兩個質粒中,red基因都是由pBAD啟動子所驅動,pBAD啟動子受L-阿拉伯糖誘導表達的araC基因所激活;質粒的復制子都是溫度敏感型復制子,在30℃才能行使復制功能,菌株需要在30℃培養(yǎng)。
　　 為了給重組工程提供更多的酶系統(tǒng),本論文中我們構建了新的重組工程菌株和載體。通過將重組酶基因整合至大腸桿菌的基因組中構建了一個新的重組工

5、程菌株大腸桿菌LS-GR。LS-GR在37℃生長,red基因受L-阿拉伯糖誘導表達。通過將含有p15A骨架的中等拷貝載體pACYC184和單拷貝的pECBAC1抗性標記基因替換進行驗證其重組功能,這兩個載體都是在分子克隆研究中經常用到的。結果表明以本菌株進行重組工程的操作簡便,重組效率高,可成為通用的重組工程用菌株。
　　 新的重組酶質粒系統(tǒng)的構建是通過兩種方式:第一種是在pKD46orf60a基因后面分別克隆orf63或orf