1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中miRNAs基因的差異表達(dá)芯片分析及相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)
　　目的:
　　利用基因芯片篩查技術(shù)，篩查早期自發(fā)流產(chǎn)和對(duì)照組蛻膜組織中差異表達(dá)的miRNAs，并通過(guò)相關(guān)靶基因網(wǎng)站查找相關(guān)靶基因，進(jìn)行生物學(xué)分析。
　　材料和方法:
　　1.收集本院早期妊娠行清宮術(shù)患者的蛻膜組織標(biāo)本，第一時(shí)間放入放有Trizol液的小試管中，-80℃液氮保存。

2、>　　2.選取早期自發(fā)流產(chǎn)病例組、正常人流對(duì)照組蛻膜組織標(biāo)本各3例，送往北京博奧生物有限公司進(jìn)行miRNA的表達(dá)芯片分析。
　　3.提取各標(biāo)本總RNA，利用miRNA基因芯片篩選早期自發(fā)流產(chǎn)病例組和對(duì)照組蛻膜組織中上調(diào)或下調(diào)1.5倍以上差異miRNA進(jìn)行聚類(lèi)分析。
　　4.通過(guò)miRWalk靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PIT

3、A、RNA22、TargetScan）對(duì)所獲得的有差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行潛在的靶基因預(yù)測(cè)。
　　5.DAVID數(shù)據(jù)軟件對(duì)差異表達(dá)miRNAs中具有血管生成和細(xì)胞凋亡功能預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO-BP、KEGG功能分析。
　　結(jié)果:
　　1.MiRNAs基因芯片篩查結(jié)果顯示:早期自發(fā)流產(chǎn)子宮蛻膜組織中（差異倍數(shù)為1.5）有70條差異表達(dá)miRNAs，其中上調(diào)差異表達(dá)miRNAs有32條，下調(diào)差異表達(dá)miRNAs有38條。<

4、br>　　2.根據(jù)差異倍數(shù)、在各檢測(cè)組織中表達(dá)量的不同及相關(guān)文獻(xiàn)，選取上調(diào)差異表達(dá)miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p，下調(diào)差異表達(dá)miR-378a-3p家族(miR-378a-3p、miR-378c、miR-422a)、miR-378a-5p，通過(guò)miRWalk網(wǎng)站查找出和血管生成相關(guān)的上調(diào)miR-125a-5p、miR-29c-3p的共同靶基因VEGFA，和血管生成、細(xì)胞侵襲相關(guān)的上調(diào)miR-125a

5、-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p的共同靶基因MMP2;和細(xì)胞凋亡相關(guān)的3條下調(diào)miR-378a-3p家族、miR-378a-5p的共同靶基因Caspase10，進(jìn)行進(jìn)一步的GO-BP以及KEGG分析。
　　3.上調(diào)差異表達(dá)miR-125a-5p、 miR-29c-3p預(yù)測(cè)靶基因VEGFA:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:具有糖蛋白、負(fù)向調(diào)控細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路、分泌等生物學(xué)功能。
　　2) KEGG分

6、析結(jié)果:通過(guò)mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、胰腺癌、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、癌癥路徑起調(diào)控作用。
　　4.上調(diào)差異表達(dá)miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p預(yù)測(cè)靶基因MMP2:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:集中在腦部和骨骼的發(fā)育，細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控。
　　2) KEGG分析結(jié)果:膀胱癌、癌癥信號(hào)通路。
　　5.下調(diào)差異表達(dá)miR-378a-3p家族、miR-

7、378a-5p預(yù)測(cè)靶基因Caspase10:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:集中在細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
　　2) KEGG分析結(jié)果:Jak-STAT信號(hào)通路、慢性粒細(xì)胞白血病、Wnt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、內(nèi)噬作用、丙氨酸天門(mén)冬氨酸和谷氨酸代謝信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)基因芯片檢測(cè)初步明確了與早期自發(fā)流產(chǎn)相關(guān)miRNAs的表達(dá)譜。
　　2.早期

8、自發(fā)流產(chǎn)脫膜組織中差異表達(dá)miRNAs可能通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶基因及多個(gè)信號(hào)通路參與調(diào)控早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　第二部分 Real-time PCR驗(yàn)證蛻膜組織中差異表達(dá)miRNAs，驗(yàn)證相關(guān)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)
　　目的:
　　利用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)兩組蛻膜組織中差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證，以確定基因芯片的準(zhǔn)確性;驗(yàn)證miRNA與各自預(yù)測(cè)的靶基因的靶向作用，同時(shí)檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因在對(duì)照和EPL患者蛻膜組織中的表達(dá)。<

9、br>　　材料和方法:
　　1.Real-time PCR方法檢測(cè)對(duì)照和EPL組蛻膜組織中差異表達(dá)上調(diào)基因miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193 c-5p和下調(diào)基因miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-378c、miR-422a的表達(dá)。
　　2.熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNAs及相關(guān)靶基因之間的關(guān)系。
　　3.Q-PCR檢測(cè)對(duì)照和EPL組蛻膜組織中相關(guān)靶基因的mRNA水平，Wes

10、ternblotting檢測(cè)其蛋白水平的表達(dá)。
　　4.Q-PCR檢測(cè)對(duì)照、黃體酮治療流產(chǎn)組和EPL組蛻膜組織中miR-378a-3p的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.Q-PCR結(jié)果顯示EPL組蛻膜組織中，miR-125a-5p、miR-29c-3p和miR-193c-5p相比正常組表達(dá)上調(diào)，與基因芯片結(jié)果一致。miR-378a-3p、miR-378c、miR-378a-5p在EPL組中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)miR-378a-3p

11、的差異更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而miR-422a的表達(dá)沒(méi)有變化，與芯片結(jié)果不相符。
　　2.熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-125a-5p、miR-29c-3p的靶基因是VEGFA。miR-125v5p、miR-29c-3p、miR-193c-5p的共同靶基因?yàn)镸MP2。miR-378a-3p和miR-378c能夠靶向Caspase3。MiR-422a、miR-378a-3p、miRNA-378c和miR-378a-5p均能直接靶向Ca

12、spase10。
　　3.在mRNA水平，預(yù)測(cè)的靶基因VEGFA在兩組中的表達(dá)無(wú)顯著性差異，而預(yù)測(cè)的靶基因MMP2在EPL蛻膜表達(dá)中有顯著性增加。此外，預(yù)測(cè)的靶基因Caspase10、Caspase3在EPL蛻膜表達(dá)中有顯著性增加(p＜0.05)。在蛋白水平，EPL蛻膜組織中，VEGFA和MMP2比對(duì)照組蛋白表達(dá)量下降，而Caspase10和Caspase3比對(duì)照組表達(dá)量增高(p＜0.05)。
　　4.MiR-378a-3p

13、在黃體酮治療流產(chǎn)組中的相對(duì)表達(dá)量較EPL組（未用黃體酮治療）升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.MiR-29c-3p、miR-125a-5p、miR-193a-5p在早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)調(diào)控靶基因VEGFA和MMP2，影響蛻膜組織的血管生成及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　2.MiR-378a-3p家族、miR-378a-5p在早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中表達(dá)下調(diào)，可能通過(guò)調(diào)控

14、細(xì)胞凋亡靶基因Caspase3和Caspase10的表達(dá)上升，導(dǎo)致蛻膜組織細(xì)胞凋亡增加，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　第三部分 MiR-378a-3p通過(guò)靶向Caspase10和Caspase3抑制蛻膜細(xì)胞凋亡從而調(diào)控早期自發(fā)流產(chǎn)
　　目的:
　　通過(guò)體外蛻膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，進(jìn)一步研究miR-378a-3p及靶基因Caspase10和Caspase3在早期自發(fā)流產(chǎn)發(fā)生中的作用。
　　材料和方法:
　　1.無(wú)菌

15、狀態(tài)下采取正常健康婦女人工流產(chǎn)的蛻膜組織，行體外原代細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行組織學(xué)鑒定。
　　2.Q-PCR、Western blotting、免疫組化測(cè)定病例組和對(duì)照組蛻膜組織中靶基因Caspase10和Caspase3的表達(dá)。
　　3.在蛻膜細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)以及干擾miR-378a-3p，檢測(cè)靶基因的表達(dá)以及蛻膜細(xì)胞增殖以及凋亡。
　　4.蛻膜細(xì)胞中加入孕激素后，以不同濃度和不同作用時(shí)間來(lái)檢測(cè)miR-378a-3p的表達(dá)。<

16、br>　　結(jié)果:
　　1.蛻膜細(xì)胞生長(zhǎng)好，經(jīng)過(guò)兩次傳代到第三代后，鏡下形態(tài)基本均一，DSC數(shù)量達(dá)90％以上。
　　2.免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示95％的細(xì)胞PRL染色呈陽(yáng)性，且細(xì)胞大小形態(tài)均一。染色特點(diǎn)為胞漿內(nèi)細(xì)小棕色顆粒，越近細(xì)胞核染色越強(qiáng)。證明本實(shí)驗(yàn)所取標(biāo)本確為蛻膜細(xì)胞。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)顯示miR-378a-3p能夠影響蛻膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-378a-3p mimic48小時(shí)后，蛻膜細(xì)胞

17、凋亡減弱，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-378a-3p inhibitor48小時(shí)后，蛻膜細(xì)胞凋亡增加，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　5.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EPL蛻膜組織中，凋亡細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加，同時(shí)Caspase3的表達(dá)比對(duì)照組高。
　　6.相同時(shí)間(24hr)內(nèi)隨著孕激素濃度增加，miR-378a-3p表達(dá)升高，表達(dá)有顯著性差異(p＜0.05);孕激素作用時(shí)間越長(zhǎng)，miR-378a-

18、3p表達(dá)上升，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)體外蛻膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和PRL檢測(cè)，建立了體外蛻膜化過(guò)程的理想模型，為miRNA的功能研究提供了良好的體外模型。
　　2.早期自發(fā)流產(chǎn)蛻膜組織中miR-378a-3p表達(dá)下降，可能通過(guò)調(diào)控Caspase3和Caspase10的表達(dá)增高，促進(jìn)蛻膜細(xì)胞凋亡增加，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　3.MiR-378a-3p在蛻膜組織中的表達(dá)