1、目的 離體條件下將HIF-1α基因轉染原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細胞，觀察轉染后細胞上清液中VEGF的表達及其對原代培養(yǎng)內皮細胞增殖的影響。 方法 1.取出生3天以內的Wistar大鼠雙下肢肌肉，利用酶消化法和差速貼壁法分離骨骼肌細胞。通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)，采用Desmin免疫組化、α-sarcometricactin免疫細胞化學法鑒定培養(yǎng)細胞類型及純度，透射電鏡觀察細胞超微結構和骨骼肌細胞特征；取120g左

2、右Wistar大鼠胸主動脈以貼塊法培養(yǎng)內皮細胞，并經過八因子相關抗原免疫細胞化學法鑒定。2.提取和擴增pHOX/HIF-1α質粒，并經酶切和測序鑒定；以陽離子脂質體(LipofectamineTM2000)介導pHOX/HIF-1α質粒轉染骨骼肌細胞并計算轉染效率；ELISA檢測轉染后VEGF蛋白在細胞內的表達及細胞外的分泌情況；將轉染質粒后的骨骼肌細胞所表達的VEGF蛋白加入血管內皮細胞的培養(yǎng)液中，用MTT法檢測其對內皮細胞增殖的促進

3、作用。 結果 1.成功培養(yǎng)出大鼠的骨骼肌細胞和內皮細胞，并經免疫組化、免疫細胞化學和透射電鏡鑒定證實。 2.成功將HIF-1α基因轉染大鼠的骨骼肌細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達；在轉染組細胞培養(yǎng)上清中檢測到VEGF表達，24h、48h、72h、96h濃度分別為1308.40±102、1449.2±69.86、1802.3±96.71、1494.95±86.24(pg/ml)，明顯高于對照組(P＜0.01)

4、；轉染后骨骼肌細胞分泌的VEGF具有正常促內皮細胞增殖的功能。轉染后骨骼肌細胞分泌的VEGF對原代培養(yǎng)的血管內皮細胞生長有顯著的促增殖作用，并呈劑量依賴性。在10-100pg范圍內，加入24h后，10pg組促增殖作用不明顯，而25、50、100pg組血管內皮細胞增殖顯著(P＜0.01)，加入48h和72h后，血管內皮細胞增殖明顯加快，與對照組相比P＜0.05。 結論 1.體外條件下成功分離、培養(yǎng)出大鼠骨骼肌細胞。