1、本研究應(yīng)用顯微技術(shù)從地生蘭與其菌根真菌的共生培養(yǎng)體系，研究地生蘭與菌根真菌之間的相互作用。廣義的蘭花是整個(gè)蘭科植物(Orchidaceae)的總稱。從我國傳統(tǒng)的“蘭花”概念上說，中國蘭花僅指產(chǎn)于我國的蘭科、蘭屬(Cymbidium)植物，而且主要指其中的地生蘭。地生蘭是一類觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的花卉。云南是全國蘭科植物分布最豐富的地區(qū)，但目前的開發(fā)與利用仍處于初級(jí)階段，由于供需矛盾突出，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，農(nóng)民上山大量采挖野生地生國蘭，

2、野生蘭花資源受到嚴(yán)重破壞，為保護(hù)瀕危蘭花資源，需大量繁殖。繁殖方法多采用組培，但移栽無菌組培苗成活率低，生長(zhǎng)緩慢，開花延遲，花小甚至不開花。成年蘭花與真菌共生形成菌根是自然界的一種普遍現(xiàn)象，菌根真菌為蘭科植物提供生長(zhǎng)所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，組培苗菌根化是促進(jìn)地生蘭快速繁殖的重要技術(shù)，也是解決瀕危蘭花資源人工栽培的關(guān)鍵。 為探討菌根真菌與蘭科植物間的相互作用機(jī)制，在盆栽和純培養(yǎng)條件下，用分離獲得的真菌菌株分別接種春蘭(Cymbid

3、iumgoeringii(Rchb.f.)Rchb.f.)、虎頭蘭(C.hookerianum)及齒瓣石斛(Dendrobiumdevonianum)。通過組培苗人工接種菌根技術(shù)篩選出與蘭花有效共生并能明顯促進(jìn)蘭苗生長(zhǎng)的優(yōu)良菌株。從生物量增長(zhǎng)、顯微和超顯微結(jié)構(gòu)、重分離接種菌株等方面獲得的證據(jù)表明，己成功建立了春蘭等種子繁育組培幼苗和絲核菌共培養(yǎng)體系；用超薄切片技術(shù)及電子顯微鏡，對(duì)蘭花營養(yǎng)根消化菌根真菌過程和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了研究，

4、探索利用蘭科內(nèi)生菌根真菌促進(jìn)地生蘭種子繁育組培幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的方法，為解決蘭科珍貴花卉人工栽培提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明： 1.春蘭、虎頭蘭和齒瓣石斛的種子在人工培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)發(fā)芽并最終形成試管苗，三種種子培養(yǎng)基配方中添加適量的椰乳及購置專門的蘭花營養(yǎng)液等，給種子提供了多種必需的營養(yǎng)生長(zhǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件，有利于種子的正常生長(zhǎng)和發(fā)育；此外種子的成熟度與在培養(yǎng)基上的萌發(fā)時(shí)間的長(zhǎng)短密切相關(guān)，成熟度越高，萌發(fā)時(shí)間越短，種子苗成活率越高；另

5、還與抑制褐變的活性碳及維生素C有關(guān)。 春蘭的莖尖組織培養(yǎng)研究篩選出有利于原球莖誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+NAAO.5mg/L+6-BA3.0mg/L；有利于不定芽的分化的培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L，有利于不定芽的增殖的培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，增殖率為4；有利于生根的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5mg/L。 2.從云南省蘭科植物的主要產(chǎn)區(qū)的

6、8個(gè)地區(qū)12品種89株蘭科植物的營養(yǎng)根上共分離獲得真菌菌株185個(gè)，其中出現(xiàn)頻率較高或者文獻(xiàn)曾報(bào)道為蘭科內(nèi)生菌根真菌的有64個(gè)代表菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)及子實(shí)體誘導(dǎo)等大致分為18類，它們分別隸屬于絲核菌屬(Rhizoctonia)、蘭科絲核菌類(Orchidaceousrhizoctonias)、毛殼菌屬(Chaetomium)、木霉屬(Trichoderma)、鐮刀菌屬(Fusarium)、Diplococc

7、oium、枝頂孢屬(Acremonium)、異孢迭球孢霉(Sarcinella)、團(tuán)絲核菌屬(Papulaspora)、Trichosporiella、Gliomastixmurorum、小菇屬(Mycena)、微囊菌屬、Catenulariapiceae、絲孢綱(Hyphomycetes)的其它屬等。 3.通過接種、生物量測(cè)定、重分離、顯微及超微觀察連續(xù)切片等，篩選出CLB211、CLB213和KW214三菌株為春蘭、虎頭蘭和

8、齒瓣石斛的優(yōu)良菌根真菌。分離自云南保山野生春蘭的CLB211、CLB213和分離自卡特蘭的KW214三個(gè)絲核菌菌株接種春蘭、虎頭蘭等組培幼苗上經(jīng)4.5個(gè)月的共生培養(yǎng)，蘭苗葉色正常、根系生長(zhǎng)良好、對(duì)幼苗生長(zhǎng)有不同程度的促進(jìn)作用，處理春蘭苗的鮮重增長(zhǎng)率(％)分別為70.6、70.2、66.1，而不接菌對(duì)照僅為45.6，CLB211、CLB213的菌株處理春蘭苗與對(duì)照達(dá)極顯著差異(α=0.01)，KW214菌株處理春蘭苗與對(duì)照達(dá)顯著差異(α=

9、0.05)。接種MLX103(分離自西雙版納野生墨蘭)、CLN115(分離自怒江貢山野生春蘭)菌株后對(duì)虎頭蘭及齒瓣石斛幼苗均有明顯的促進(jìn)作用。春蘭、虎頭蘭、齒瓣石斛等組培苗接種能與其共生并形成菌根的優(yōu)良菌根真菌后可明顯促進(jìn)蘭苗的生長(zhǎng)，并由此認(rèn)為不同種類的蘭花在同一地區(qū)可以具有相同的菌根真菌，同一種蘭花在不同的地區(qū)可以具有不同的菌根真菌，再一次證明蘭花菌根真菌的專一性不是很強(qiáng)的。 4.應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡連續(xù)觀察春蘭、墨蘭、

10、虎頭蘭、齒瓣石斛、玫瑰石斛、卡特蘭等的菌根結(jié)構(gòu)，真菌先通過根被組織，在具有通道細(xì)胞的蘭根中，真菌菌絲自外皮層薄壁通道細(xì)胞侵入皮層細(xì)胞，如春蘭、虎頭蘭、齒瓣石斛、鐵皮石斛、玫瑰石斛、卡特蘭；而在無通道細(xì)胞的蘭根中，則是通過破壞根被組織和外皮層細(xì)胞來侵入皮層細(xì)胞，如墨蘭。進(jìn)入皮層組織細(xì)胞，并通過菌絲穿越細(xì)胞壁不斷向內(nèi)延續(xù)擴(kuò)展，光學(xué)顯微鏡下觀察到的在皮層細(xì)胞內(nèi)形成大量著色較深形狀不規(guī)則的菌絲團(tuán)(Pelotons)。在電子顯微鏡下觀察是圍繞細(xì)胞