1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記
　　目的：
　　通過(guò)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)BMSCs，研究BMSCs的生物學(xué)特性和形態(tài)學(xué)特征。用熒光標(biāo)記BMSCs，通過(guò)描繪、對(duì)比其生長(zhǎng)曲線來(lái)比較熒光染料對(duì)BMSCs細(xì)胞活性的影響。
　　方法：
　　1.無(wú)菌條件下取大鼠的股骨和脛骨，用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化BMSCs。待細(xì)胞鋪滿瓶底90％左右，1:2進(jìn)行傳代。
　　2.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)

2、胞表面抗原，鑒定是否為目的細(xì)胞。
　　3.選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)21天，行茜素紅和von Kossa改良染色法，觀察其產(chǎn)生鈣結(jié)節(jié)能力。
　　4.用CM-Dil標(biāo)記BMSCs，觀察其標(biāo)記能力。通過(guò)計(jì)數(shù)和對(duì)比非標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目，并繪制生長(zhǎng)曲線，明確CM-Dil對(duì)BMSCs增殖能力影響。
　　結(jié)果：
　　1.SD大鼠骨髓細(xì)胞全貼壁培養(yǎng)24h后部分貼壁，呈大小不能的球形；48h后大部分細(xì)胞貼壁，呈紡錘形或星

3、形；6-7d后可以進(jìn)行首次傳代。
　　2.所培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞99%以上表達(dá) CD29，CD44和CD90，不表達(dá)CD34，CD45。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。
　　3.茜素紅染色可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)呈紅色，Von Kossa改良染色法光鏡下可見(jiàn)被染成紅色的細(xì)胞團(tuán)塊中間有粗大的黑色結(jié)節(jié)。證明間充質(zhì)干細(xì)胞確實(shí)被誘導(dǎo)成了成骨細(xì)胞并且有鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生。
　　4. CM-Dil對(duì)BMSCs的即時(shí)標(biāo)記率為100%，通過(guò)觀察、計(jì)數(shù)、對(duì)比其細(xì)胞

4、形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差別。
　　結(jié)論：
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法能獲得理想的BMSCs。
　　2.BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后有產(chǎn)生鈣結(jié)節(jié)的能力。
　　3.CM-Dil能夠有效的標(biāo)記BMSCs,且不會(huì)影響其生物學(xué)性質(zhì)，是體外示蹤的有效方法。
　　第二部分大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立
　　目的：
　　有效建立大鼠椎體骨質(zhì)疏松模型并鑒定是否骨質(zhì)疏松。
　　方法：
　　1.雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)。

5、
　　2.通過(guò)觀察大鼠陰道分泌物涂片，確認(rèn)是否切除卵巢成功。
　　結(jié)果：
　　切除卵巢的大鼠不再有性動(dòng)周期，連續(xù)一周的陰道分泌物涂片均停留在動(dòng)情間期。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)去除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松模型的方法是可行的。
　　2.通過(guò)連續(xù)觀察大鼠陰道分泌物涂片能夠判斷大鼠去勢(shì)成功。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合雙膦酸鹽治療骨質(zhì)疏松椎體的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　在前期建立椎體

6、骨質(zhì)疏松模型基礎(chǔ)上，給予大鼠相應(yīng)椎體移植不同濃度BMSCs以及雙膦酸鹽治療，通過(guò)測(cè)量相關(guān)指標(biāo)，判斷其療效。
　　方法：
　　1.12周齡未交配過(guò)的雌性大鼠100只，隨機(jī)分為5組，每組20只。①對(duì)照組；②去勢(shì)組；③去勢(shì)+移植組；④去勢(shì)+雙膦酸鹽組；⑤去勢(shì)+移植+雙膦酸鹽組。
　　2.采用切除雙側(cè)卵巢的方法構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。去勢(shì)12周后，將CM-Dil標(biāo)記的P3代BMSCs，用1ml注射器以5×104/ml、5×105/m

7、l、5×106/ml、5×107/ml、5×108/ml濃度的細(xì)胞懸液等體積分別注入③組和⑤組大鼠L2--L6的椎體，L1椎體注入等體積的熒光懸液。④組和⑤組大鼠給予阿侖膦酸鈉灌胃處理（8.2mg/kg），每周一次，連續(xù)12周。所有大鼠均在同一條件下喂養(yǎng)。
　　3.治療后12w分別處死相應(yīng)組大鼠20只。
　　4.通過(guò)硬組織磨片機(jī)制作骨磨片，熒光顯微鏡觀察干細(xì)胞是否移植成功。
　　5.通過(guò)MicroCT測(cè)量相關(guān)的骨代謝指

8、標(biāo)，判斷是否有療效。
　　結(jié)果：1.移植干細(xì)胞后12w制作骨組織磨片，熒光顯微鏡下觀察，能觀察到新生骨小梁中有紅色熒光發(fā)出。
　　2.將切除雙側(cè)卵巢的大鼠于12w后分別通過(guò)Micro-CT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)②組大鼠相比于①組大鼠其椎體BMD，Tb.N，Tb.Th，BV/TV是顯著下降的。BMD降低了37.86%（P＜0.05）；Tb.N降低了77.25%（P＜0.05）；Tb.Th降低了43.48%（P＜0.05）；BV/TV降低了

9、66.67%（P＜0.05）。
　　3.Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，④組和②組相比，ALE治療能明顯改善大鼠椎體松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)，BMD升高了16.19%（P＜0.05）；Tb.N升高了49.61%（P＜0.05）；Tb.Th升高了57.69%（P＜0.05）；BV/TV升高了55.56%（P＜0.05）。
　　4.Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，③組大鼠L1與②組大鼠椎體骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)相差不大。隨著B(niǎo)MSCs移植濃度的升高，L2-L

10、6椎體呈現(xiàn)出BV/TV，Tb.Th，Tb.N，BMD
　　逐漸增加， BS/BV， Tb.Sp逐漸降低的趨勢(shì)。
　　5.Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，⑤組和③組相比，L2-L6椎體骨密度均升高，L1椎體骨密度與④組骨密度接近，⑤組和①組相比，L6椎體骨密度接近，但前者依然低于后者。
　　結(jié)論：
　　1.熒光標(biāo)記的干細(xì)胞椎體移植成功。
　　2.通過(guò)摘除大鼠雙側(cè)卵巢可成功建立骨質(zhì)疏松模型，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，去勢(shì)大鼠的骨