1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，簡稱金葡菌，是一種自然界中廣泛存在的革蘭陽性致病菌，能夠引起心內膜炎、敗血癥、肺炎和腦膜炎等多種疾病。α-溶血素(alpha hemolysin，Hla)是金葡菌致病的關鍵毒力因子之一，其相對分子質量為33000。作為穿孔毒素(pore forming toxin，PFT)家族成員之一，Hla蛋白在宿主細胞的膜表面形成七聚體的功能形式，穿透細胞膜繼而導致細胞裂解。然而很多研究

2、表明，Hla蛋白亦具有非PFT作用，如通過影響免疫細胞進而影響機體免疫系統(tǒng)，但是具體機制尚不清楚。進一步的研究則表明Hla蛋白與細胞膜表面的ADAM10蛋白結合促進七聚體的形成，同時Hla蛋白通過與ADAM10蛋白相互作用抑制A549細胞中Src激酶的磷酸化水平。
　　蛋白激酶Src參與細胞分化、遷移、增殖、存活等多個過程，不僅可影響下游信號的級聯(lián)反應，也參與了B細胞受體(B cell receptor, BCR)信號轉導過程。B

3、CR介導的信號通路對B細胞發(fā)育、抗體產(chǎn)生等過程至關重要。
　　本研究的第一部分為金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體蛋白的表達純化及中和性抗體的制備。具體內容有:
　　1.Hla蛋白的表達純化及活性驗證。通過構建Hla蛋白的表達載體，利用原核表達系統(tǒng)大腸桿菌重組表達Hla蛋白。通過紅細胞裂解實驗測定Hla蛋白的溶血活性，驗證其對不同種屬紅細胞的裂解作用的差異。
　　2.Hla蛋白的突變體蛋白HlaH35L的表達純化及活性

4、驗證。通過重疊PCR方法將Hla蛋白除信號肽之外的第35個氨基酸組氨酸(H)替換為亮氨酸(L)，并測定突變體蛋白的溶血活性，結果發(fā)現(xiàn)與文獻報道一致，其不能夠裂解兔紅細胞。
　　3.Hla蛋白中和性抗體的制備。制備并純化Hla蛋白的特異性多克隆抗體，溶血活性檢測結果顯示Hla蛋白的多克隆抗體能夠抑制Hla蛋白介導的兔紅細胞裂解作用，表明該抗體具有良好的中和活性。
　　本文的第二部分為Hla蛋白抑制BCR信號通路機制的初步研究。

5、具體內容如下:
　　1.Hla蛋白可與小鼠B細胞系WEHI-231特異性結合。通過流式細胞術和免疫熒光實驗證實Hla蛋白可與WEHI-231細胞特異性結合。細胞轉染實驗則證實該結合部分依賴于Hla蛋白受體ADAM10。同時證實突變體蛋白HlaH35L與Hla蛋白具有一致的結合活性。
　　2.Hla蛋白抑制BCR信號通路機制的初步研究。CCK-8實驗結果發(fā)現(xiàn)Hla蛋白可以抑制anti-IgM所誘導的WEHI-231細胞凋亡。W

6、estern Blotting結果則表明，與A549細胞不同，Hla蛋白及突變體蛋白都能夠誘導WEHI-231細胞Src的磷酸化，BCR通路活化則導致Src磷酸化程度降低，Hla蛋白可通過誘導Src的磷酸化繼而影響B(tài)CR信號通路。綜上所述，我們成功獲得了純度較高的金葡菌重組Hla蛋白及其突變體HlaH35L蛋白，制備并純化了具有良好中和活性的Hla蛋白的特異性多克隆抗體。進一步我們發(fā)現(xiàn)，Hla蛋白及突變體蛋白都能夠通過結合ADAM10誘