1、真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一種Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶，eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位點發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致降低eEF2與核糖體的結(jié)合能力進而抑制肽鏈延伸。通過近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，許多類型的癌細胞中均呈現(xiàn)eEF2K高表達或高度活化，尤其是在膠質(zhì)瘤、乳腺癌中最為明顯。eEF2K表達水平或者活性的改變還將影響細胞的許多生理進程，例如，細胞周期、細胞分化、細胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改

2、變與細胞自噬進程的調(diào)控又是其中的熱點，在膠質(zhì)瘤細胞系和乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)eEF2K活性增強能夠誘導(dǎo)自噬，抑制eEF2K活性誘導(dǎo)的自噬能夠增加多種藥物的有效性。到目前為止對非小細胞肺癌細胞株中eEF2K的研究還基本處于空白階段。吉非替尼為為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的代表藥物，也是臨床上常用的治療非小細胞肺癌的藥物，但是隨著作用時間的延長會逐漸出現(xiàn)耐藥，限制了吉非替尼的應(yīng)用。
　　本課題目的:旨在觀察在非小細胞肺癌中eEF2K是否與細

3、胞自噬和死亡存在聯(lián)系并研究eEF2K是否參與吉非替尼的耐藥，為將來eEF2K作為抗腫瘤靶標提供更加充實的證據(jù)。
　　第一部分非小細胞肺癌細胞株中吉非替尼誘導(dǎo)eEF2K活化與細胞自噬
　　在本部分實驗中采用吉非替尼處理非小細胞肺癌發(fā)現(xiàn)，吉非替尼能夠顯著增強非小細胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的時間和劑量依賴性。通過免疫沉淀對自噬相關(guān)蛋白LC3和P62檢測、免疫熒光檢測自噬體顆粒狀的形成以及通過透射電鏡

4、對自噬體形成的檢測，發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠?qū)е路切〖毎伟┲凶允苫钚郧揖哂袝r間和劑量依賴性。而且還發(fā)現(xiàn)由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增強在時間和濃度上存在一致性，表明兩者可能存在某種聯(lián)系。
　　第二部分非小細胞肺癌細胞株中eEF2K與細胞自噬和死亡關(guān)系的研究
　　1、抑制eEF2K活性或干擾其表達后對由吉非替尼引發(fā)自噬的影響
　　通過貧血清方法測定A484954在非小細胞肺癌中抑制eEF2K最適作用濃度100

5、uM以及最適作用時間為6h，然后通過采用eEF2K小分子抑制劑以及加入其干擾片段抑制eEF2K的活性或者表達后，發(fā)現(xiàn)對由吉非替尼引起的自噬沒有影響。并且通過對同樣能夠引起非小細胞肺癌株中eEF2K活性升高以及自噬活性增強的化合物Stattic試驗，也得出同樣的結(jié)論。
　　2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性對細胞生存的影響
　　eEF2K的抑制并不能對由吉非替尼引起的自噬產(chǎn)生影響，接下來分別對由吉非替尼引起的eEF2K活性

6、升高、自噬活性增強及細胞生存能力情況三者進行探討。發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌株中通過3-MA抑制自噬的活性能夠明顯增強吉非替尼的藥效，而通過A484954抑制eEF2K活性或者干擾其表達后在吉非替尼處于高濃度的情況下能夠降低吉非替尼的藥效，使得細胞生存能力增強且這種增強作用在提前將eEF2K活性抑制后效果更為明顯。
　　3、eEF2K在非小細胞肺癌細胞株中的作用及作用機制初探
　　在無吉非替尼作用下，通過A549細胞干擾eEF2K后

7、細胞計數(shù)和平板克隆發(fā)現(xiàn)eEF2K被抑制以后能夠?qū)е录毎婺芰Φ脑黾?，并能夠引起自噬活性的增強。而在乳腺癌細胞中eEF2K被抑制可以減少自噬并抑制乳腺癌細胞生長。通過本研究我們初步明確了抑制eEF2K對吉非替尼引起的自噬無明顯影響和導(dǎo)致細胞存活增加的原因可能是在非小細胞肺癌中eEF2K自身可抑制細胞自噬與細胞增殖。
　　意義:通過本課題研究確定了在非小細胞肺癌細胞株中eEF2K不參與吉非替尼介導(dǎo)的耐藥并且還發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌細胞株