1、納米微泡可使組織增強(qiáng)顯影，還可在超聲輻照下定向釋放所攜載的藥物和基因，為解決腎癌鑒別診斷和治療所面臨的困難提供了可能。鑒于腎癌相關(guān)抗原G250是一種膜蛋白，在絕大多數(shù)腎癌高表達(dá)而正常腎組織不表達(dá)，故可作為納米微泡的靶點(diǎn)。同時(shí)，納米抗體體積小、特異性強(qiáng)，作為配體有助于實(shí)現(xiàn)靶向納米微泡的小型化。
　　目的：
　　通過(guò)免疫駱駝制備能與腎癌相關(guān)抗原G250蛋白胞外區(qū)特異性結(jié)合的納米抗體，將其與納米微泡連接制備靶向納米微泡，驗(yàn)證其腎癌

2、靶向性，為下一步開展腎癌的鑒別診斷及靶向治療提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方式將包含G250蛋白胞外區(qū)基因片段的質(zhì)粒導(dǎo)入到真核細(xì)胞HEK293F中表達(dá)G250胞外區(qū)，以該重組蛋白免疫新疆雙峰駝，構(gòu)建噬菌體展示納米抗體庫(kù)。通過(guò)體外定向篩選，得到能與G250蛋白胞外區(qū)特異性結(jié)合的噬菌體，以Monoclonal phage ELISA方法篩選出具有結(jié)合活性的噬菌體克隆。通過(guò)細(xì)胞ELISA和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證淘選到的

3、納米抗體的細(xì)胞結(jié)合活性。制備空白納米微泡，采用生物素-親和素技術(shù)將G250納米抗體連接于納米微泡之上。通過(guò)免疫熒光驗(yàn)證靶向納米微泡構(gòu)建是否成功。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定786-O、HeLa和ACHN三種細(xì)胞G250抗原表達(dá)情況;通過(guò)觀察納米微泡與細(xì)胞的結(jié)合情況評(píng)估納米微泡的靶向性。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)測(cè)序證實(shí)編碼G250的重組DNA片段序列正確，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)G250重組蛋白成功表達(dá)。通過(guò)免疫新疆雙峰駝，成功構(gòu)建

4、了庫(kù)容為2.87×109的噬菌體展示駱駝VHH免疫文庫(kù)。在體外對(duì)免疫納米抗體庫(kù)進(jìn)行了3輪固相篩選，使具有結(jié)合活性的噬菌體克隆得到了有效富集，陽(yáng)性率高達(dá)54.3％。經(jīng)過(guò)抗原ELISA、細(xì)胞ELISA鑒定，篩選出3個(gè)具有細(xì)胞結(jié)合活性的納米抗體噬菌體克隆，取其中結(jié)合活性最高的Nb-G5進(jìn)行表達(dá)、純化，產(chǎn)量為1.5mg每升培養(yǎng)物。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nb-G5對(duì)G250表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力。免疫熒光結(jié)果表明靶向納米微泡構(gòu)建成功，細(xì)