1、紫莖澤蘭是我國為害最嚴重的惡性外來入侵雜草之一,原產(chǎn)于墨西哥至哥斯達黎加一帶,后作為觀賞植物引入歐洲,目前已廣泛分布于世界30多個國家和地區(qū).該草于20世紀40年代經(jīng)緬甸傳入我國,短短幾十年間已經(jīng)遍布我國西南地區(qū)6個省市,并以每年幾十公里的速度向我國北方地區(qū)擴散. 植物在長期進化中普遍形成了可誘導(dǎo)激活的抗逆境潛能.植物響應(yīng)低溫逆境形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,并受多種調(diào)控基因和功能基因的控制,這種信號互作關(guān)系在先前的研究中已經(jīng)得到證實.

2、紫莖澤蘭作為一種熱帶亞熱帶植物有逐步向溫帶蔓延的趨勢,必然有其特殊的抗寒機制,這很可能與調(diào)控因子的控制有關(guān).在擬南芥、番茄、棉花等多種植物中發(fā)現(xiàn)的CBF轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)答低溫逆境的關(guān)鍵調(diào)控因子之一,一直倍受重視.在綜述了紫莖澤蘭入侵機制及國內(nèi)外關(guān)于低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF研究進展的基礎(chǔ)上,本文從紫莖澤蘭低溫調(diào)控因子CBF的克隆入手,進行了了紫莖澤蘭CBF序列分析比對、誘導(dǎo)表達分析、種群間遺傳差異及遺傳轉(zhuǎn)化等一系列研究,為從分子層面上解釋紫

3、莖澤蘭低溫適應(yīng)性機制奠定了基礎(chǔ).主要結(jié)果如下: 1.通過分析擬南芥、番茄等植物的CBF氨基酸核心區(qū)設(shè)計簡并引物,以DNA為模板,獲得了4個同源性在70﹪以上的核心區(qū)片段.根據(jù)已知片段設(shè)計特異引物,運用RACE技術(shù)從低溫誘導(dǎo)下的紫莖澤蘭cDNA中獲得一個全長800bp的CBF基因,定名為EaCBF1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼一個由219個氨基酸組成的蛋白,預(yù)測分子量為22.4kD.該蛋白具有7個非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的核定位信號,

4、60個氨基酸組成的保守AP2結(jié)合域,以及一個3'的酸性轉(zhuǎn)錄激活域.不同植物CBF1基因比對顯示,EaCBF1與蘋果CBF1基因親緣關(guān)系最近其次是番茄,和葡萄的CBF1最遠. 2.由于CBt 基因家族成員間同源性高且多半為單拷貝基因,我們以EaCBF1為探針通過Southem雜交確定了紫莖澤蘭基因組內(nèi)至少有4個CBF家族成員,與核心區(qū)克隆測序結(jié)果一致. 3.運用半定量RT-PCR技術(shù)分析了 EaCBF1 在不同逆境脅迫下的

5、表達水平.結(jié)果顯示,EaCBF1在低溫下表達量最高,其次是干旱和外源ABA,而高鹽脅迫也會誘導(dǎo)該基因的微弱表達.表明各種逆境信號間有串話現(xiàn)象.為了進一步研究EaCBF1的功能,我們構(gòu)建了一個含有CaMV35S啟動子的組成型植物表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中,已獲得了轉(zhuǎn)基因植株,生理生化檢測正在進行中. 4.應(yīng)用等位基因SNP技術(shù)檢測了15個地理種群EaCBF1編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性.通過測序比對發(fā)現(xiàn),目前我國西

6、南幾個受紫莖澤蘭危害較大的省市所采集的植物樣本的EaCBF1在核苷酸水平上有11個堿基的差異,而由于密碼子的簡并性,其氨基酸水平上有3處差異.這些結(jié)果表明該基因的核苷酸序列已經(jīng)形成一定程度的遺傳分化,主要表現(xiàn)在云南、四川及貴州種群相對于重慶和廣西百色種群具有更高的多態(tài)性.從整體趨勢看云南種群與四川和貴州種群親緣關(guān)系近,與重慶和廣西種群相對較遠. 本研究以CBF 低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子為對象從溫度這個限制物種分布的關(guān)鍵環(huán)境因子入手,分析