1、如何對基因組進行快速有效的測序是當今基因組科學面臨的主要挑戰(zhàn)之一。在成功完成人類基因組計劃之后，生命科學界最重要的工作之一是獲取所有個體的基因組序列，并依據(jù)獲取的結果了解不同個體基因序列間的差異，分析不同個體對疾病的易感程度的差異，以及在藥物反應上的差異。這是未來5-10年生命科學的核心研究之一。 成熟的DNA測序技術出現(xiàn)在上70年代中期，Maxam的化學降解法和Sanger的雙脫氧鏈終止法幾乎同時出現(xiàn)在1977年。進入20世紀

2、80年代，四色熒光標記的測序引物法和熒光標記雙脫氧核苷酸鏈終止法分別被商品化，標志著自動化測序時代的到來。經(jīng)過近30年的發(fā)展，目前已有種類繁多的DNA測序技術，價格、認讀長度、通量(速度)是判斷一種測序方法優(yōu)劣的標準。利用DNA微陣列高通量的特點，我們設計了基于DNA微陣列在片延伸技術的DNA測序新方法(中國專利申請?zhí)枺?00610096372．4)，開展了相關的研究工作，通過特定引物與待測靶序列雜交后進行在片延伸的方法，在延伸過程中用

3、熒光標記的雙脫氧核苷酸終止部分待測靶序列，通過檢測微陣列熒光信號的方法獲取序列信息，木論文的主要內(nèi)容如下： 1．測序用DNA微陣列制備的優(yōu)化： 分別制備醛基修飾玻片片基的DNA微陣列和瓊脂糖膜涂覆玻片片基的DNA微陣列，比較在兩種片基在片延伸的效率，結果表明，瓊脂糖膜涂覆玻片片基具有較高的信號點熒光強度，但同時也具有較高的熒光背景。分別設計具有不同長度手臂分子的寡核苷酸探針，比較這些探針的延伸效率，結果表明，具有較長手臂

4、分子長度的寡核苷酸探針具有較高的在片延伸效率。 2．在片延伸體系的優(yōu)化： 現(xiàn)有的在片延伸體系是針對單堿基延伸(Single Base Extension，SBE)技術開發(fā)的，我們針對基于在片延伸DNA測序技術的需要，對現(xiàn)有的反應體系和方法進行了優(yōu)化。比較了Tdq DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶在延伸效率的差別，實驗表明Therminator DNA聚合酶具有最佳的延伸效率和

5、良好的保真性。比較了三種核苷酸體系用于在片延伸的差異，結果表明逐次加入具有相同核苷兩種核苷酸(熒光標記的雙脫氧核苷酸和普通脫氧核苷酸)的混合物作為延伸反應的核苷酸體系，可以滿足在片多堿基延伸測序的要求。比較了熒光標記的雙脫氧核苷酸和普通脫氧核苷酸的濃度比例對在片延伸信號的影響，實驗表明當固定熒光標記的雙脫氧核苷酸的濃度不變，隨著普通脫氧核苷酸濃度的不斷增高，熒光信號強度隨之不斷下降。 3．基于在片延伸的DNA測序技術研究：

6、 在前兩項研究的基礎上，運用在片延伸技術進行DNA序列的測定。在單步多堿基測序?qū)嶒炛?，運用在片延伸的方法，準確地測定了寡核苷酸探針最長4個堿基的序列信息，驗證了基于在片延伸DNA測序技術的可行性。在多步多堿基測序?qū)嶒炛校\用在片延伸的方法，準確地測定了寡核苷酸探針最長10個堿基的序列信息。町以相信，對在片延伸技術的一些改進可以延長該方法的認讀長度，最終使基于在片延伸的DNA測序技術成為一項在價格、認讀長度和通量上都具有優(yōu)勢的測序技術。