1、本研究根據(jù)Genbank中CTX-M-1組超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的基因序列為目的基因，設(shè)計(jì)并合成了特異性引物，采用PCR技術(shù)，以產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出CTX-M型ESBLs全基因，將全基因序列克隆到PGM-T載體上并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明其開(kāi)放閱讀框有876個(gè)堿基，編碼291個(gè)氨基酸。將序列結(jié)果送交國(guó)際B-內(nèi)酰胺酶認(rèn)證機(jī)構(gòu)(http://www.lahey.org/Studies)，證實(shí)本研究擴(kuò)增的序列是

2、一種新型的CTX-M型ESBLs基因，命名為CTX-M-69(GenBank登錄號(hào)：EU402393)，蛋白質(zhì)序列編號(hào)為ABY91281.1。將CTX-M-69核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外其它CTX-M型ESBLs進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，CTX-M-69序列與CTX-M-1(GenBank登錄號(hào)：X92506)的核苷酸同源性為98％(867/877)，與CTX-M-1編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)：CAA63262.1)

3、同源性為98％(287/291)，確定CTX-M-69基因?qū)儆贑TX-M-1組。與CTX-M-1相比，有10個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變，其中6個(gè)位點(diǎn)為無(wú)義突變，4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換。同時(shí)，與GenBank上同一組的部分CTX-M型氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，同源性達(dá)到了98.9％以上。 采用PCR技術(shù)，以CTX-M-69基因克隆載體為模板，擴(kuò)增出蛋白的編碼基因(876bp)，并將其插入pET-30b(+)表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建了ESBLsCTX

4、-M-69重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明表達(dá)出33kD左右的融合蛋白，可溶性檢測(cè)表明表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式(上清中)和包涵體形式(沉淀中)兩種形式存在。通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，試驗(yàn)確定ESBLsCTX-M-69蛋白表達(dá)的最佳條件為誘導(dǎo)物WrG0.4mmol/L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，在最佳表達(dá)條件下，重組蛋白表達(dá)含量有較明顯的提高。CTX-M-69基因工程菌對(duì)頭孢噻肟、

5、頭孢他啶、含克拉維酸的頭孢噻肟和頭胞他啶的藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明基因工程菌符合產(chǎn)超廣譜B-內(nèi)酰胺酶的表型特征(NCLLs2006)，表明CTX-M-69基因工程菌產(chǎn)ESBLs。同時(shí)，重組蛋白對(duì)12種B-內(nèi)酰胺類(lèi)水解活性的測(cè)定表明抗菌譜與CYX-M-1組大致相當(dāng)，最大的區(qū)別在于CTX-M-69型ESBLs對(duì)頭孢他啶的水解能力較弱。試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明CTX-M-69型ESBLs在pH為7.8～8.6，溫度為30℃時(shí)活性最大，底物濃度過(guò)大時(shí)酶