1、肝糖原是哺乳動物體內重要的能量儲存物質。糖原在體內分布廣泛，人體內主要集中在肝臟和骨骼肌，其中肝糖原能夠維持體內的血糖平衡。從結構上來看，糖原是由葡萄糖單體組成的高度分枝化的高分子物質，可以劃分為三種不同的結構層級：一級結構由葡萄糖單體通過α-(1,4)鍵形成直鏈，通過α-(1,6)鍵形成支鏈，平均支鏈的長度大概是12個葡萄糖單體；二級結構由這些直鏈和支鏈連接成β粒子，直徑大概在20nm左右；三級結構是由β粒子連接成的更大粒徑的α粒子，

2、直徑大概在100nm。
　　本課題研究集中在第三級結構層面，主要研究肝糖原小粒徑β-粒子結合成大粒徑α-粒子的蛋白質。通過對比db/db小鼠（一種二型糖尿病模型）的肝糖原與正常小鼠肝糖原的結構差別，找出肝糖原結合蛋白并研究這種差異與肝糖原結合蛋白的定性定量關系，以期尋找治療糖尿病的新型藥物靶點。
　　本論文由四個部分組成。
　　第一部分，建立將肝糖原分子與其表面結合蛋白分離純化的可行性方法。第一：使用胰蛋白酶將肝糖原表

3、面結合蛋白降解成多肽，并通過超濾離心管（MWCO）除去，同時用分析型體積排阻色譜（SEC）檢驗肝糖原是否會降解；第二：使用制備型SEC根據(jù)肝糖原分子與蛋白質分子大小的差異來分離純化肝糖原。然后，將兩種方法分離純化得到的肝糖原使用α-淀粉酶降解以釋放肝糖原分子當中所有的蛋白質，再用高分辨質譜儀（Triple-TOF）進行蛋白質組學檢測，以蛋白組學數(shù)據(jù)中含有肝糖原相關蛋白最少者確立為最佳分離純化方法。經(jīng)過蛋白質組學定性分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶降

4、解方法純化的肝糖原分子仍可以結合多種雜質蛋白；但是經(jīng)制備型SEC純化之后的肝糖原只含有一種與肝糖原分子相關蛋白-glycogenin，其余為實驗操作過程當中摻入的雜質蛋白。發(fā)現(xiàn)通過制備型SEC純化后的肝糖原分子具有最純凈最準確的蛋白質組。
　　第二部分，在體外通過轉基因技術表達出被檢測出的肝糖原連接蛋白，并進行體外驗證實驗，確認該連接蛋白能夠成功將小粒徑β-粒子連接成大粒徑的α-粒子。通過轉基因技術將表達該蛋白的基因剪切進大腸桿菌

5、質粒載體中，并將該載體轉染入大腸桿菌中進行培養(yǎng)，表達出目標蛋白，然后通過多種手段檢測蛋白活性并降解掉其表面的多糖，再與小鼠體內提取出的肝糖原進行混合反應，檢測肝糖原粒徑大小，以提供該肝糖原結合蛋白作為肝糖原連接分子的直接證據(jù)。Glycogenin分子具有多糖連接活性，通過體外培養(yǎng)實驗驗證該結論并研究其連接機制，目前仍在進行中。
　　第三部分，采用蛋白組學分析方法，尋求將小粒徑β-粒子連接成大粒徑α-粒子的關鍵蛋白。然后將所得到的蛋

6、白質進行定量實驗，探索在相應質譜條件下對痕量蛋白質進行定量的可行性，并確認可靠的定量條件，比較糖尿病小鼠和正常小鼠體內該連接蛋白的定量差異。提出糖尿病肝糖原的病理結構模型，并使用SEC和熒光輔助毛細管電泳（FACE）等多種檢測手段對該病理模型進行驗證。經(jīng)定量蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的肝糖原與正常小鼠體內肝糖原的連接蛋白在β-粒子分子內部存在顯著差異，前者肝糖原β-粒子內部的glycogenin蛋白即使不經(jīng)α-淀粉酶處理也能被胰蛋白