1、目的：通過體內(nèi)外染氟實驗及體外Smo siRNA阻斷Hh信號通路，觀察氟致大鼠軟骨損害中Hh信號通路相關因子表達水平變化及軟骨細胞凋亡情況，以探討氟中毒致軟骨損傷的發(fā)病機制，為地氟病的預防及治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:（1）體內(nèi)實驗：36只健康SD大鼠按體重隨機分為對照組（飲用含氟量<1 mg/L自來水）、低氟組、高氟組（飲水含氟量分別為5 mg/L、50 mg/L），每組12只（雌雄各半）。飼養(yǎng)6個月后，股動脈放血處死，應用氟

2、離子電極法檢測各組大鼠尿氟、骨氟含量；HE染色后光鏡觀察關節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學的改變； IHC和Wb法檢測軟骨組織Hh信號通路中Shh、Smo、BMP-2及凋亡相關調(diào)控蛋白Bcl-2及Bax表達情況。（2）體外實驗：取1周齡健康SD大鼠4只，用機械-酶消化法分離關節(jié)軟骨細胞；甲苯胺藍對原代軟骨細胞進行鑒定，常規(guī)細胞培養(yǎng)，待細胞傳至2代細胞融合至70％時，分別加入濃度為0（對照組）、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 m

3、M的含氟培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況，篩選出最適氟濃度；以慢病毒為載體將Smo siRNA1~3轉入軟骨細胞，72 h后，Wb檢測Smo表達含量，篩選出抑制作用最強片段后將實驗分為空白對照組、氟中毒組、control siRNA（陰性對照）組及Smo siRNA組；各組細胞培養(yǎng)72 h后采用Wb檢測Shh、Smo、BMP-2、Bcl-2和Bax蛋白表達情況；逆轉錄PCR檢測Shh、Smo、BMP-2

4、mRNA表達水平；流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。
　　結果：1、低氟組及高氟組的尿氟、骨氟（3.66±0.43、402.38±33.77；8.05±0.60、935.12±49.60）含量均較對照組（1.12±0.16、106.45±11.28）升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2、HE結果顯示，對照組大鼠軟骨邊緣基本整齊，細胞呈柱狀排列。隨著染氟劑量增加，各染氟組干骺端出現(xiàn)不同程度軟骨骨化，骨小梁增寬，具有硬化性氟骨癥改變

5、。3、Wb結果顯示，低氟組、高氟組Shh、Smo、BMP-2及Bax蛋白表達（0.86±0.09、0.92±0.11、1.02±0.10、0.91±0.14；1.11±0.15、1.17±0.15、1.13±0.12、0.92±0.11）較對照組（0.62±0.07、0.74±0.09、0.77±0.11、0.63±0.06）升明顯升高，Bcl-2蛋白表達（0.78±0.03；0.57±0.09）較對照組（0.84±0.10）明顯降低，

6、 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4、原代軟骨細胞提取成功，表現(xiàn)為經(jīng)甲苯胺藍染色時，細胞內(nèi)可見紫紅色的異染顆粒。5、MTT結果顯示，染氟72 h后，濃度為0.125、0.25、0.5 mM組細胞活力（120.83±7.21、123.17±4.62、118.51±10.09）較對照組升高，濃度為1.0、2.0、4.0 mM組細胞活力（82.13±6.25、35.16±4.84、7.03±2.23）較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義

7、（P＜0.05）。6、Smo siRNA1~3均可不同程度抑制Smo因子的表達，以Smo siRNA2片段抑制作用最強。7、Wb及逆轉錄PCR結果顯示，氟中毒組與陰性對照組Shh、Smo及BMP-2蛋白（0.94±0.05、0.89±0.07、1.06±0.15；1.00±0.09、0.86±0.05、1.14±0.13）和mRNA（0.67±0.04、0.46±0.06、0.77±0.06；0.61±0.04、0.51±0.07、0.

8、79±0.06）的表達較空白對照組（0.70±0.06、0.69±0.06、0.83±0.12；0.53±0.06、0.34±0.03、0.69±0.06）明顯升高，Smo siRNA組（0.52±0.03、0.47±0.06、0.59±0.06；0.42±0.05、0.28±0.06、0.50±0.03）與空白對照組及陰性對照組相比其表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。8、流式結果顯示，與空白對照組細胞凋亡率相比（11.04

9、±1.11），氟中毒組與陰性對照組細胞凋亡率（18.49±0.80；17.97±1.07）明顯升高，Smo siRNA組（40.32±1.79）升高更為明顯。與空白對照組Bax、Bcl-2的表達及Bax/Bcl-2的比值（0.88±0.06；1.05±0.07；0.85±0.09）相比，氟中毒組與陰性對照組Bax表達（1.07±0.10；1.19±0.12）升高，Bcl-2表達（0.74±0.03；0.76±0.05）降低，Bax/Bc

10、l-2比值（1.45±0.13；1.56±0.15）升高，Smo siRNA組（1.39±0.10；0.50±0.03；2.29±0.21）變化更為明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：1、氟中毒時軟骨組織可出現(xiàn)不同程度的骨化，具有硬化性氟骨癥的病理改變。2、在一定條件下，低濃度的氟對大鼠原代軟骨細胞具有促進增殖作用，而高濃度具有促進凋亡作用。3、Hh信號通路可能與凋亡以及其它因素共同參與氟致軟骨損傷的機制及發(fā)病過