1、林貴斌：Spred一2與Rabl1相互作用影響大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞PCI2分化lSpred2與Rabl1相互作用影響大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞PCI2分化研究生：林貴斌導師：孟松樹教授中文摘要Spred(SproutyrelatedwithEVHldomain)蛋白家族是一類酪氨酸激酶結(jié)合蛋白。Spred蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成，分別為：N端EVH1結(jié)構(gòu)域，中央KBD結(jié)構(gòu)域和C端SPR結(jié)構(gòu)域。目前哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的Spred蛋白家族成員主要

2、為Spred1、Spred2、Spred3和Eve3。Spred3缺少KBD結(jié)構(gòu)域，Eve3僅含有EVH1結(jié)構(gòu)域。Spred特異性抑制多種生長因子誘導的Ras／Raf／Erk信號通路活化，抑制細胞分化，但具體機制復雜，有待進一步闡明。Spred2在不同腺體和分泌組織中均有較高表達，主要定位于細胞內(nèi)囊泡狀結(jié)構(gòu)，與循環(huán)內(nèi)吞體標志蛋白Rabll共定位。Rabll參與細胞內(nèi)囊泡運輸，促進神經(jīng)突生長。我們之前的研究及其他研究均表明，Spred2抑

3、制大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞PCI2分化，但機制不明。我們推測Rabll可能參與Spred2調(diào)控的PCI2細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)Spred一2與Rabll相互作用，并且與自噬標志蛋白LC3存在共定位。研究結(jié)果如下：1、免疫熒光檢測HeLa細胞內(nèi)源Spred2與內(nèi)源Rabll定位，結(jié)果表明二者在胞漿中存在聚點狀的共定位；將MycSpred2與HARabl1共轉(zhuǎn)至293T細胞經(jīng)AntiMyc抗體免疫共沉淀，免疫印跡結(jié)果表明Spred2與Rabl

4、l存在相互作用。2、將MycSpred2野生型及其各個結(jié)構(gòu)域缺失突變體，分別與’HARabl1共轉(zhuǎn)至293T細胞，以AntiMyc抗體免疫共沉淀，免疫印跡結(jié)果表明Spred2蛋白通過C端的KBD與SPR結(jié)構(gòu)域與Rabll相互作用。3、將MycSpred2、DsRedRabll及綠色熒光蛋白標記的LC3(GFPLC3)共同轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，免疫熒光結(jié)果表明Spred2、Rabll及LC3三者在胞漿存在共定位。4、分別將Myc標簽空載體，

5、MycSpred2野生型及SPR結(jié)構(gòu)域缺失突變體與DsRed—Rabll和GFPLC3，共轉(zhuǎn)至HeLa細胞，免疫熒光結(jié)果表明Spred2蛋白SPR結(jié)構(gòu)域為Rabll與LC3共定位所必需。5、共轉(zhuǎn)DsRedRabll與GFPLC3至HeLa細胞，再分別使用雷帕霉素(Rapa)與氯喹(CQ)處理，免疫熒光結(jié)果表明Rapa促進Rabll與LC3共定位，而CQ抑制二者共定位。6、分別將Spred2野生型及其突變體重組腺病毒感染PCI2細胞，神經(jīng)

6、突觸生長分析結(jié)果表明SPR結(jié)構(gòu)域及其與LC3結(jié)合位點為Spred2抑制PCI2細胞分化所必需。綜上所述，Spred2抑制PCI2細胞分化可能通過C端區(qū)域與Rabll相互作用，抑制Rabll參與細胞分化的功能。Spred2缺失SPR結(jié)構(gòu)域，Rabll釋放，并促進神經(jīng)突生長。林貴斌：Spred一2與Rabll相互作用影響大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞PCI2分化三Spred—2interactionwithRabllaffectsratpheoc

7、hromocytomaPC12celldifferentiationMSCandidate：LinGuibinSupervisor：ProfMengSongshuAbstractSpred(SproutyrelatedwithEVH1domain)proteins(Spreds)aretyrosinebnasebindingproteinsSpredfamilymemberscontainallNterminalEnabled／VASP

8、Homology1domain(EVH1)，acentralcKitbindingdomain(KBD)andaCterminalSproutyrelateddomain(SPR)CurrentlytheSpredproteinfamilyinmammalsmainlyconsistsofSpred1，Spred2，Spred一3andEve一3Spred一3lacksKBDdomainwhileEve3consistsofonlyEV

9、H1domainSpredsinhibittheactivationofRas／RaffErkpathwaybyawiderangeofdifferentgrowthfactorsandblockcelldifferentiationbuttheunderlyingmechanismiscomplexandremainstobeelucidatedSpred2isstronglyexpressedindifferentglandular

10、andsecretorytissues，mainlylocalizesinvesiclelikestructureandCO—localizes、析threcyclingendosomalmarkerproteinRabl1Rabl1isintracellularvesicletransportrelatedandpromotesneuriteoutgrowthOurpreviousresearchandstudiesbyotherre

11、searchersshowedthatSpred一2inhibitsratpheocllromocytomacellsPC12differentiation，butthemechanismislargelyunknownWehypothesizedthatRabl1maybeinvolvedinSpred2regulationofPC12celldifferentiationThisstudyfoundthatSpred2interac

12、ted謝t11Rabll，andCOlocalizedwitllautophagymarkerproteinLC3Themainresultsaresummarizedasfollows：1ImmunofluorescenceassaysdetectthelocalizationofendogenousSpred2andendogenousRabllinHeLacells，theresultsshowedthattheycolocali

13、zedincytoplasmicpunctae293TcellsweretransfectedwithMyc—Spred一2andHARabll，andthewholecelllysateswereCOimmunoprecipitatedwithanti—MycImmunoblotresultsshowedthatSpred一2interactedwithRabll2293TcellsweretransfectedwithMycSpre

14、d一2wildtypeordomaindeletionmutantsandHARabll，andthewholecelllysateswereCO—immunoprecipitatedwithanti—MycImmunoblotresultsshowedthatSpred一2interactedwithRabl1viaitsCterminaldomain3HeLacellsweretransfectedwithMyc—Spred2，Ds