1、研究背景
　　心肌結(jié)構(gòu)組織內(nèi)的膠原纖維異常積累，而導(dǎo)致心肌內(nèi)膠原的濃度明顯升高或是膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)增多，各種類型的膠原排序混亂及比例失衡的現(xiàn)象叫做心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）。大多研究表明，MF是多種疾病如心力衰竭、高血壓和心肌梗死等心血管疾病的一種基礎(chǔ)病變，同時也是心肌組織重新構(gòu)象的表現(xiàn)之一。心肌纖維化的發(fā)展過程受到包括免疫系統(tǒng)、機(jī)體細(xì)胞因子和

2、RAAS系統(tǒng)在內(nèi)的多種因素影響，不同型別的心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制并不完全相同。同時MF的形成機(jī)制也受到血管緊張素、內(nèi)皮素、一氧化氮、轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子和細(xì)胞內(nèi)鈣離子等多種因素的調(diào)節(jié)。從整體米說，心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成、代謝和降解不平衡導(dǎo)致了心肌纖維化的發(fā)生。心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）是心肌細(xì)胞外基質(zhì)分泌的主要細(xì)胞，它具有較強(qiáng)的增殖能力，沒有收縮能力，主要負(fù)責(zé)心臟細(xì)胞間質(zhì)的產(chǎn)生和沉淀。心肌

3、成纖維細(xì)胞可以調(diào)節(jié)自身膠原物質(zhì)的形成及心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，這是通過不斷合成和分泌生物活性物質(zhì)實現(xiàn)的。同時，它可以與心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)電機(jī)械能力、細(xì)胞因子的分泌和血管的生成。正常情況下，成人CFs處于平衡靜止的狀態(tài)。病理條件下，CFs表型發(fā)生轉(zhuǎn)換，可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞—一種分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)能力更強(qiáng)的細(xì)胞，從而表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth mscle actin

4、，α-SMA）導(dǎo)致膠原合成、分泌增多。這可以看做是心肌纖維化的一個重要發(fā)生機(jī)理。因此，為有效預(yù)防和治療心肌纖維化，需進(jìn)一步探索CFs表型轉(zhuǎn)化的可能調(diào)控機(jī)制，找到肌成纖維絀胞的作用靶點。
　　微小RNA分子（MicroRNA，miRNA）廣泛存在于生物體內(nèi)，是一種在生物進(jìn)化過程中較為保守的非編碼小分子RNA。它通過調(diào)控基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和翻譯，在生命進(jìn)程和疾病發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。心血管系統(tǒng)中有獨特的miRNA表達(dá)系統(tǒng)。已有研究表

5、明，miRNA可通過直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和調(diào)控多種與纖維化相關(guān)的信號通路參與纖維化過程，廣泛參與諸如高血壓、糖尿病、心肌梗死等心血管疾病的心肌纖維化過程。目前關(guān)于miRNA與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系尚處于開始階段，而已有結(jié)論大多來自于體外動物實驗，miRNA在人類心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的明確。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與miRNA之間的相互作用對疾病發(fā)生及發(fā)展有重要的調(diào)控作用

6、。
　　Wnt信號通路是一類可以調(diào)控組織器官發(fā)育，參與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它由一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)構(gòu)成，包括多種調(diào)控Wnt信號分子合成的蛋白質(zhì)。Wnt信號通路既可以參與成年人正常的生理過程，也可以調(diào)節(jié)胚胎及癌癥的形成。大多研究證實，它在肝、腎、肺及心肌纖維化等纖維化疾病的發(fā)生過程中有重要作用。其作用機(jī)制可能是可以激活纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，但具體的作用機(jī)制尚不明確。Wnt信號通路主要包括經(jīng)典和非經(jīng)典通路，Wnt/

7、β-catenin是最為典型的一個通路，β-catenin是該通路中的一個最為重要的信號分子。信號傳導(dǎo)過程中受多種抑制因子的影響，如分泌型卷曲蛋白（SFRP家族）和WIF-1和DKKs家族。國內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)，它可能對纖維化疾病的發(fā)生和效應(yīng)細(xì)胞的激活有調(diào)控作用，存在器官之間的差異性，具體的發(fā)生機(jī)制尚不明確。已有研究表明，miRNA和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間在心肌纖維化過程中可能存在調(diào)控關(guān)系。但是，目前對于Wnt信號通路與miRNA之問的作

8、用具體機(jī)制尚不明確，兩者在心肌纖維化中的相互調(diào)控關(guān)系還有待深入研究探討。
　　miR-154是人類染色體14q32上的一個miRNA，在腫瘤研究中有較高的表達(dá)，在纖維化疾病中，目前只有其在肺纖維化中的作用研究，在心肌纖維化中研究較少。有研究表明，miR-154等一系列microRNAs的異常表達(dá)能導(dǎo)致心肌肥厚與心力衰竭。DKK(Dickkopf)是一種漸進(jìn)性保守小基因家族，是分泌型糖蛋白的一種，是經(jīng)典Wnt通路的抑制因子。有研究發(fā)

9、現(xiàn)miR-154在DKK2、SFRP4、WIF-1上具有靶位點，這說明miR-154有可能通過調(diào)控上述因子而激活Wnt通路。綜上所述，我們推測miR-154可以在心肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)，并且在心肌纖維化過程中呈現(xiàn)上升趨勢。miR-154和Wnt信號通路之間也可能存在某種調(diào)控作用。因此本研究以人心肌成纖維細(xì)胞為研究靶點，觀察miR-154誘發(fā)心肌纖維化表達(dá)的變化情況，并探討miR-154對Wnt信號傳導(dǎo)通路在心肌纖維化過程中可能的作用。

10、r>　　研究目的
　　探討miR-154對心肌纖維化的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確miR-154與Wnt通路之間存在的調(diào)控機(jī)制，為臨床心肌纖維化的治療探尋新的干預(yù)靶點。
　　研究方法
　　1、第一部分，采用由ScienCell實驗室(Carlsbad，CA，USA)提供的人心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，合成miR-154模擬物和抑制物并轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中，采用BrdU檢測細(xì)胞增殖率，采用Western blot方法檢測Ⅰ和Ⅲ型膠

11、原、a-SMA（肌樣成纖維細(xì)胞標(biāo)記物）的表達(dá)，以探討miR-154對心肌纖維化過程的影響。
　　2、第二部分，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，并結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)對miR-154的靶基因進(jìn)行預(yù)測，尋找miR-154參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的線索。登錄miRBase、miRanda和TargetScan基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測和分析miR-154調(diào)控心肌纖維化可能作用于Wnt/β-catenin信號通路的靶點。將靶基因的3'UTR克隆到psi

12、CHECK-2中，同時將預(yù)測的miR-154結(jié)合位點進(jìn)行突變，然后分別與miR-154的模擬物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。
　　在明確miR-154的靶基因后，進(jìn)一步驗證miR-154調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞活化是否通過所在靶基因的通路（Wnt/β-catenin通路）進(jìn)行。首先構(gòu)建已找到的靶基因DKK2過表達(dá)載體和合成靶基因的siRNA。實驗分組分為7組，分別為:空白對照組、陰性對照組、miR-154抑制物轉(zhuǎn)染組、miR

13、-154模擬物轉(zhuǎn)染組、DKK2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、DKK2-siRNA轉(zhuǎn)染組、miR-154模擬物+DKK2過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組。各組分別轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，用Wstem blot檢測miR-154靶基因、β-catenin、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá);用BrdU檢測成纖維細(xì)胞的增殖;采用PI染色流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期的改變及凋亡情況;用Transwell檢測細(xì)胞遷移。
　　研究結(jié)果
　　1、CFs轉(zhuǎn)染miR-154模擬物和

14、miR-154抑制物后，BrdU檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-154模擬物組的細(xì)胞增殖率高于miR-154抑制物組(P＜0.01)。進(jìn)一步用Western blot檢測后發(fā)現(xiàn)，miR-154模擬物組成纖維細(xì)胞中α-SMA、collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)增高，而miR-154抑制物組中α-SMA、collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)有所降低，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、通過檢

15、索miRBase、miRanda和TargetScan基因數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻(xiàn)分析方法，我們發(fā)現(xiàn)，DKK2是miR-154在Wnt/β-catenin信號通路中的一個靶基因。進(jìn)一步進(jìn)行熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染克隆有DKK2野生型3'UTR的載體時，與對照組相比熒光素酶活性顯著下降(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染克隆有突變型DKK23'UTR的載體時，熒光素酶活性變化不顯著。說明了DKK2是miR-154的一個作用靶點。
　　3、用miR-15

16、4干預(yù)成纖維細(xì)胞，經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-154能上調(diào)β-catenin、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型膠原在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.01)，而用siRNA下調(diào)DKK2表達(dá)時也能顯著上調(diào)上述蛋白的表達(dá)（P＜0.01）;當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-154抑制物后，β-catenin、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。
　　4、BrdU檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-154模擬物時，CFs的增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0

17、.01);下調(diào)DKK2表達(dá)時，CFs增殖也明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　5、流式細(xì)胞分析方法發(fā)現(xiàn)，抑制miR-154表達(dá)或過表達(dá)DKK2時，Sub-G1峰的比例明顯增加，會促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡，miR-154過表達(dá)或DKK2表達(dá)下調(diào)時，會抑制成纖維細(xì)胞的凋亡。
　　6、Transwell法檢測細(xì)胞遷移發(fā)現(xiàn)，miR-154能增強(qiáng)CFs的遷移能力(P＜0.01)，DKK2過表達(dá)時，CFs的遷移能力顯著下降(P＜0.01)。