1、人巨細(xì)胞病毒含有約20～25種蛋白質(zhì)，其中在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制中有3種蛋白作用最為重要，即由ORFUL82編碼的磷蛋白pp71、ORFUL83編碼的pp65和ORFUL69編碼的PUL69。上述3種蛋白共同的特點(diǎn)是啟動(dòng)HCMV對(duì)宿主細(xì)胞的感染和病毒的復(fù)制，同時(shí)在逃逸T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明，在這3種間層蛋白中以O(shè)RFUL82編碼的蛋白pp71的作用最為顯著，該pp71蛋白單獨(dú)存在時(shí)，是一種較強(qiáng)

2、的抗原蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，有助于清除病毒；在器官移植者,HCMV感染后pp71蛋白的產(chǎn)生可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)，從而引起移植物血管病變和排斥反應(yīng)[1]。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤,pp71蛋白的產(chǎn)生可以引起腫瘤蛋白P105、P107、P130等的衰變[2,3]。pp71蛋白可以誘導(dǎo)靜止的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并使它們停止在G1晚期，而這段時(shí)期對(duì)病毒復(fù)制最為有利，所以它能夠增加病毒繁殖，加快病毒在細(xì)胞間傳遞，體外將HCM

3、V轉(zhuǎn)染人纖維細(xì)胞后，病毒DNA復(fù)制效率在共轉(zhuǎn)染ORFUL82條件下，感染及復(fù)制效率增加了80倍[4-8]。研究證實(shí)pp71不僅對(duì)HCMV的IE1和IE2基因表達(dá)有促進(jìn)作用，而且對(duì)晚期基因的表達(dá)以及病毒向正常宿主細(xì)胞的傳播具有促進(jìn)和加強(qiáng)作用。因此,Baldick指出，ORFUL82(pp71蛋白)可作為抗HCMV病毒藥物設(shè)計(jì)的有效靶點(diǎn)[9]。 為進(jìn)一步研究pp71蛋白基因在真核細(xì)胞-人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)中的表達(dá)，為抗HCMV

4、pp71間層蛋白人源化基因工程抗體庫(kù)的建立、篩選奠定基礎(chǔ)，本研究進(jìn)行了以下工作： 1.人包皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 取已凍存的第3代HFF細(xì)胞，在含10％小牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近鋪滿培養(yǎng)瓶壁時(shí)，按1：3分瓶培養(yǎng)，并標(biāo)記傳代時(shí)間，代數(shù)及細(xì)胞名稱，于37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將傳至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第14代HFF細(xì)胞封管凍存，以備后用。 2.基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71的鑒定

5、 (1)利用氯化鈣法將重組質(zhì)粒pSG5-pp71轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌內(nèi)。 (2)提取重組質(zhì)粒pSG5-pp71，以BamHI、EcoRI單酶和雙酶切方法初步鑒定陽(yáng)性克隆基因；設(shè)計(jì)引物，用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒，然后測(cè)序。對(duì)pp71基因DNA片段的測(cè)序結(jié)果，與基因庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較，同源性約為99.82％,說(shuō)明重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建。 3.基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71在HFF細(xì)胞中的表達(dá)與純化鑒定

6、 (1)基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71在人包皮纖維細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。 (2)以抽提的HFF細(xì)胞總RNA為模板，合成的兩對(duì)引物為擴(kuò)增對(duì)象，行RT-PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)是否成功。 (3)表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSG5-pp71的人包皮成纖維細(xì)胞裂解物依次經(jīng)Ni-NTA親和層析純化及SDS-PAGE蛋白電泳后,Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在Mr為71000左右處有一條針對(duì)pp71抗體的特異性條帶，與理